Метаболомики Анализ мозга крысы путем высокого разрешения ядерной магнитно-резонансной спектроскопии тканевых экстрактах

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Мышиные модели были использованы широко в исследовании мозга ^1. Генотип-фенотипа были исследованы в мышей и крыс мозга при изучении генной экспрессии в РНК и / или уровней белка, с одной стороны, и морфологические, функциональные, электрофизиологические и / или поведенческие фенотипы с другой ^2-6. Однако, чтобы полностью понять механизмы, связывающие фенотип генотипа, необходимо исследовать молекулярные события после экспрессии белка, т.е.. Метаболизм биохимических субстратов, на которых ферменты действуют ^7. Это требование привело, в течение последних 10 до 15 лет, к возрождению метаболического исследования во многих отраслях биологии ^8,9. В то время как классические метаболические исследования часто были сосредоточены на деталях конкретных путей, новый метаболомики подход ориентирован на всеохватывающей исследования глобального метаболического профиля ткани рассматриваемой.Одним из следствий этой концепции является очевидная потребность в аналитических инструментов, которые минимизируют уклон в сторону конкретных метаболических путей и / или классов соединений. Тем не менее, классические биохимические анализ основан на определенной химической реакции конкретного анализируемого вещества, которое должно быть указано до того, как анализ проводят. Напротив, спектроскопические методы, такие как ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (MS) (я) основаны на конкретных молекулярных (физических) свойств биохимических соединений, каждое из которых порождает одного или нескольких различных сигналов в спектре обнаружены в ходе одного эксперимента; и (II) обнаруживает большое количество различных соединений в эксперименте.

Таким образом, каждый спектр содержит комбинированную информацию целого ряда метаболитов. По этой причине, спектроскопические методы адекватные средства для метаболомики, а не до выбора не должно быть сделано в отношении природы аналита, подлежащего измерению ⁸ </suр>. Как следствие, эти методы, естественно, поддаются поисковых исследований, потому что они значительно облегчит обнаружение неожиданных метаболических изменений.

Хотя ЯМР-спектроскопии и масс могут быть использованы как взаимозаменяемые для анализа многих метаболитов, каждый метод обладает специфическими преимуществами и недостатками, которые недавно были рассмотрены ^10. Вкратце, ЯМР-спектроскопии, как правило, могут быть выполнены из неочищенных экстрактов и не требует хроматографического разделения образцов соединений перед анализом. Напротив, MS работает с газовой или жидкостной хроматографии (ГХ или ЖХ) разделения, для конкретных недавних событиях, таких как изображения масс-спектрометрии исключением. В нескольких особых случаях, таких как анализ сахара, разделение LC может стать необходимостью для ЯМР-спектроскопии, а также, потому что резонансные линии различных сахаров значительно перекрываются в протон ^(1Н) спектров ЯМР. Тем не менее, ¹ Н ЯМР-спектроскопии без CHRomatographic разделение остается самым популярным, почти повсеместно прикладное метод метаболомики ЯМР. Как правило, подготовка образца является более трудоемким и сложным для MS, чем для ЯМР-спектроскопии. Серьезные проблемы, связанные с матричных эффектов гораздо менее распространены в ЯМР-спектроскопии, чем в MS, где они могут привести к значительно ослабленных сигналов. Метаболит количественный может быть достигнуто при любом способе. Тем не менее, несколько стандартных соединений, необходимых для MS вследствие различий в матричных эффектов и эффективности ионизации между метаболитов. В противоположность этому, только один стандарт на образец необходим для ЯМР спектроскопического анализа, потому что при соответствующих условиях измерения, последний способ является внутренне количественные благодаря строго линейного отклика ЯМР на наблюдаемых ядер. Основным недостатком ЯМР является его относительно низкая чувствительность. MS, в частности LC-MS, является более чувствительным, чем ЯМР на несколько порядков; По этой причине, МС должна быть более предпочтительным, чем ЯМР дляАнализ соединений, возникающих при очень низких концентрациях. С другой стороны, неразрушающего характер эксперимента ЯМР является явным преимуществом по сравнению с МС; таким образом, ЯМР может быть выполнена повторно на том же образце, например, для разных ЯМР-активных ядер, таких как ¹ H, фосфор-31 ⁽³¹ P), углерод-13 ^(13С), фтор-19 ⁽¹⁹ F) и т.д.., а материал не потребляется ЯМР, в отличие от измерений МС.

Оба ЯМР и МС могут быть использованы в различных режимах, каждый из которых является оптимальным для выявления соединений с конкретными химическими характеристиками. Например, ³¹ P ЯМР часто лучше подходит, чем ¹ Н ЯМР для анализа умеренно концентрированных фосфорилированных соединений, хотя почти все фосфорилированные метаболиты также содержат протоны. Тем не менее, их сигналы ^{1Н ЯМР} может маскироваться ¹ сигналов ЯМР H от других, не фосфорилированными соединений, в то время как последнийочевидно, не вызывают фоновые сигналы в ³¹ спектров ЯМР Р. В аналоговой ситуации, ^{19-ЯМР-анализ} F является предпочтительным для фторированных соединений, например, фторированных препаратов (не фоновых сигналов от эндогенных метаболитов), в то время как частный случай ¹³ С ЯМР представляет интерес почти исключительно, если судьба ¹³ С- меченые экзогенные метаболические предшественники должна быть дополнена, в связи с крайне низким естественным изобилием ¹³ С изотопом (около 1%). Многие масс-спектрометры работают в любом отрицательном режиме ионного или режиме положительных ионов. Таким образом, важно знать заранее, анализа ли ионы, которые должны соблюдаться отрицательно или положительно заряженные. Мы сосредоточимся на протокол для анализа мозговой ткани метаболом по ¹ H и ³¹ P ЯМР-спектроскопии, потому что этот метод дает большое количество важных концентрации метаболитов при низкой стоимости в терминах (I) время, необходимое для пробоподготовки ай (II) усилие, необходимое для количественного определения метаболита. Все эксперименты могут быть выполнены с использованием оборудования стандартной влажной химической лаборатории и высокого разрешения ЯМР спектроскопии центр. Дополнительные требования описаны в разделе протокола ниже.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: ANIMAL ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ Исследования на животных на крысах в соответствии с руководящими действительные во Франции, и они были одобрены местным комитетом по этике (# 40.04, Университет Экс-Марсель медицинской школы, Марсель, Франция) по. 1 Сбор и замораживание моз…

Representative Results

Для получения наилучшего разрешения в метаболической спектров ЯМР головного мозга и других тканевых экстрактов, она уже давно распространенная практика, чтобы удалить или ионы маска металлические (что наиболее важно: парамагнитные ионы), присутствующие в экстракте решений. Это было д…

Discussion

ЯМР-спектроскопия является эффективным методом для измерения концентрации химических соединений в растворе в очень воспроизводимым и точным образом. Однако, чтобы получить качественную данные необходимо придерживаться определенных правил, связанных с подготовкой и анализ проб. При…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913