The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).
Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.
Мышиные модели были использованы широко в исследовании мозга 1. Генотип-фенотипа были исследованы в мышей и крыс мозга при изучении генной экспрессии в РНК и / или уровней белка, с одной стороны, и морфологические, функциональные, электрофизиологические и / или поведенческие фенотипы с другой 2-6. Однако, чтобы полностью понять механизмы, связывающие фенотип генотипа, необходимо исследовать молекулярные события после экспрессии белка, т.е.. Метаболизм биохимических субстратов, на которых ферменты действуют 7. Это требование привело, в течение последних 10 до 15 лет, к возрождению метаболического исследования во многих отраслях биологии 8,9. В то время как классические метаболические исследования часто были сосредоточены на деталях конкретных путей, новый метаболомики подход ориентирован на всеохватывающей исследования глобального метаболического профиля ткани рассматриваемой.Одним из следствий этой концепции является очевидная потребность в аналитических инструментов, которые минимизируют уклон в сторону конкретных метаболических путей и / или классов соединений. Тем не менее, классические биохимические анализ основан на определенной химической реакции конкретного анализируемого вещества, которое должно быть указано до того, как анализ проводят. Напротив, спектроскопические методы, такие как ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (MS) (я) основаны на конкретных молекулярных (физических) свойств биохимических соединений, каждое из которых порождает одного или нескольких различных сигналов в спектре обнаружены в ходе одного эксперимента; и (II) обнаруживает большое количество различных соединений в эксперименте.
Таким образом, каждый спектр содержит комбинированную информацию целого ряда метаболитов. По этой причине, спектроскопические методы адекватные средства для метаболомики, а не до выбора не должно быть сделано в отношении природы аналита, подлежащего измерению 8 </suр>. Как следствие, эти методы, естественно, поддаются поисковых исследований, потому что они значительно облегчит обнаружение неожиданных метаболических изменений.
Хотя ЯМР-спектроскопии и масс могут быть использованы как взаимозаменяемые для анализа многих метаболитов, каждый метод обладает специфическими преимуществами и недостатками, которые недавно были рассмотрены 10. Вкратце, ЯМР-спектроскопии, как правило, могут быть выполнены из неочищенных экстрактов и не требует хроматографического разделения образцов соединений перед анализом. Напротив, MS работает с газовой или жидкостной хроматографии (ГХ или ЖХ) разделения, для конкретных недавних событиях, таких как изображения масс-спектрометрии исключением. В нескольких особых случаях, таких как анализ сахара, разделение LC может стать необходимостью для ЯМР-спектроскопии, а также, потому что резонансные линии различных сахаров значительно перекрываются в протон (1Н) спектров ЯМР. Тем не менее, 1 Н ЯМР-спектроскопии без CHRomatographic разделение остается самым популярным, почти повсеместно прикладное метод метаболомики ЯМР. Как правило, подготовка образца является более трудоемким и сложным для MS, чем для ЯМР-спектроскопии. Серьезные проблемы, связанные с матричных эффектов гораздо менее распространены в ЯМР-спектроскопии, чем в MS, где они могут привести к значительно ослабленных сигналов. Метаболит количественный может быть достигнуто при любом способе. Тем не менее, несколько стандартных соединений, необходимых для MS вследствие различий в матричных эффектов и эффективности ионизации между метаболитов. В противоположность этому, только один стандарт на образец необходим для ЯМР спектроскопического анализа, потому что при соответствующих условиях измерения, последний способ является внутренне количественные благодаря строго линейного отклика ЯМР на наблюдаемых ядер. Основным недостатком ЯМР является его относительно низкая чувствительность. MS, в частности LC-MS, является более чувствительным, чем ЯМР на несколько порядков; По этой причине, МС должна быть более предпочтительным, чем ЯМР дляАнализ соединений, возникающих при очень низких концентрациях. С другой стороны, неразрушающего характер эксперимента ЯМР является явным преимуществом по сравнению с МС; таким образом, ЯМР может быть выполнена повторно на том же образце, например, для разных ЯМР-активных ядер, таких как 1 H, фосфор-31 (31 P), углерод-13 (13С), фтор-19 (19 F) и т.д.., а материал не потребляется ЯМР, в отличие от измерений МС.
Оба ЯМР и МС могут быть использованы в различных режимах, каждый из которых является оптимальным для выявления соединений с конкретными химическими характеристиками. Например, 31 P ЯМР часто лучше подходит, чем 1 Н ЯМР для анализа умеренно концентрированных фосфорилированных соединений, хотя почти все фосфорилированные метаболиты также содержат протоны. Тем не менее, их сигналы 1Н ЯМР может маскироваться 1 сигналов ЯМР H от других, не фосфорилированными соединений, в то время как последнийочевидно, не вызывают фоновые сигналы в 31 спектров ЯМР Р. В аналоговой ситуации, 19-ЯМР-анализ F является предпочтительным для фторированных соединений, например, фторированных препаратов (не фоновых сигналов от эндогенных метаболитов), в то время как частный случай 13 С ЯМР представляет интерес почти исключительно, если судьба 13 С- меченые экзогенные метаболические предшественники должна быть дополнена, в связи с крайне низким естественным изобилием 13 С изотопом (около 1%). Многие масс-спектрометры работают в любом отрицательном режиме ионного или режиме положительных ионов. Таким образом, важно знать заранее, анализа ли ионы, которые должны соблюдаться отрицательно или положительно заряженные. Мы сосредоточимся на протокол для анализа мозговой ткани метаболом по 1 H и 31 P ЯМР-спектроскопии, потому что этот метод дает большое количество важных концентрации метаболитов при низкой стоимости в терминах (I) время, необходимое для пробоподготовки ай (II) усилие, необходимое для количественного определения метаболита. Все эксперименты могут быть выполнены с использованием оборудования стандартной влажной химической лаборатории и высокого разрешения ЯМР спектроскопии центр. Дополнительные требования описаны в разделе протокола ниже.
ЯМР-спектроскопия является эффективным методом для измерения концентрации химических соединений в растворе в очень воспроизводимым и точным образом. Однако, чтобы получить качественную данные необходимо придерживаться определенных правил, связанных с подготовкой и анализ проб. При…
The authors have nothing to disclose.
Support by Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) is gratefully acknowledged.
Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
Electronic scale | Sartorius | n/a | |
Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15-mL, 30-mL tube |
Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10-mL volumes |
Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96 % deuterated |
Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96 % deuterated |
Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20 % in deuterium oxide |
Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30 % in deuterium oxide |
Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL |
Pipet-Aid | Drummond | XP | |
NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity |
Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |