Introduction
Mausmodelle sind weitgehend in der Hirnforschung 1 verwendet worden. Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in Maus-und Rattenhirne durch das Studium der Genexpression auf RNA-und / oder Protein-Ebene auf der einen Seite auf die andere 2-6 untersucht und morphologischen, funktionellen, elektrophysiologischen und / oder Verhaltens Phänotypen. Um jedoch die Mechanismen der Verknüpfung von Genotyp-Phänotyp zu vollständig zu verstehen, ist es unerlässlich, die molekularen Ereignisse hinter der Protein-Expression, dh zu untersuchen. der Stoffwechsel der biochemischen Substrate, auf denen Enzyme wirken 7. Diese Anforderung führte in den vergangenen 10 bis 15 Jahren, zu einer Renaissance der Stoffwechselforschung in vielen Bereichen der Biologie 8,9. Während klassische Stoffwechselstudien haben oft auf Details der besonderen Fachrichtungen ausgerichtet ist, wird die neue Metabolomics Ansatz einer umfassenden Untersuchung der globalen Stoffwechselprofil des Gewebes unter Berücksichtigung ausgerichtet.Eine Folge dieses Konzepts besteht ein offensichtlicher Bedarf für analytische Werkzeuge, die Ausrichtung auf bestimmte Stoffwechselwege und / oder Klassen von Verbindungen zu minimieren. Jedoch ist eine klassische biochemische Assays auf eine bestimmte chemische Reaktion eines spezifischen Analyten festgelegt werden, bevor der Test durchgeführt wird, die Bedürfnissen. Im Gegensatz dazu werden spektroskopische Techniken, wie kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) (i) zu bestimmten molekularen (physikalischen) Eigenschaften von biochemischen Verbindungen, bezogen von denen jede zu einem oder mehreren verschiedenen Signale in einem Frequenz im Verlauf eines Experiments erfasst; und (ii) erkennen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verbindungen pro Experiment.
So enthält jedes Spektrum die kombinierten Informationen über eine ganze Reihe von Stoffwechselprodukten. Aus diesem Grund, spektroskopische Verfahren sind geeignete Werkzeuge für metabolomics, da keine vorherige Selektion muss gemacht bezüglich der Art des Analyten zu messenden 8
Obwohl NMR und MS austauschbar für die Analyse von vielen Metaboliten verwendet werden, besitzt jedes Verfahren spezifische Vor-und Nachteile, die vor kurzem wurden bewertet 10. Kurz gesagt, können NMR-Spektroskopie üblicherweise aus Rohextrakten durchgeführt werden und erfordert keine chromatographische Trennung der Probenverbindungen vor der Analyse erfordert. Im Gegensatz dazu arbeitet MS mit Gas oder Flüssigkeits-Chromatographie (GC oder LC) Trennung, mit Ausnahme insbesondere die jüngsten Entwicklungen wie der Massenspektrometrie Bildgebung. In einigen speziellen Fällen, wie die Analyse von Zucker, kann LC-Trennung eine Notwendigkeit für die NMR-Spektroskopie als auch geworden, weil die Resonanzlinien aus verschiedenen Zuckerarten überschneiden sich in den Proton (1 H)-NMR-Spektren. Dennoch, 1 H-NMR-Spektroskopie ohne chromatographic Trennung bleibt die beliebteste, fast allgemein angewandte metabolomische NMR-Methode. Im Allgemeinen ist die Probenvorbereitung zeitaufwendig und komplex für MS, als es für NMR-Spektroskopie. Schwerwiegende Probleme auf Matrixeffekte sind viel in der NMR-Spektroskopie weniger verbreitet als in MS, wo sie deutlich gedämpften Signale führen. Metabolit Quantifizierung kann mit beiden Methoden erreicht werden. Jedoch werden mehrere Standardverbindungen für MS aufgrund von Variationen in Matrixeffekte und Ionisation Wirkungsgrade zwischen Metaboliten benötigt. Im Gegensatz dazu wird nur eine Standard pro Probe für ein NMR-spektroskopischen Analyse, weil unter geeigneten Messbedingungen erforderlich ist, ist das letztere Verfahren eigen quantitative dank der streng linearen NMR-Antwort von den Kernen beobachtet. Ein Hauptnachteil der NMR ist seine relativ geringe Empfindlichkeit. MS, insbesondere LC-MS, ist empfindlicher als NMR um mehrere Größenordnungen; Aus diesem Grund ist MS über NMR für das vorzuziehenAnalyse der Verbindungen in sehr geringen Konzentrationen auftreten. Andererseits ist die zerstörungsfreie Art der NMR-Experiment wird ein klarer Vorteil gegenüber MS; auf diese Weise NMR wiederholt an der gleichen Probe, beispielsweise für unterschiedliche NMR-aktiven Kernen, wie 1 H, 31-Phosphor (31 P), Kohlenstoff-13 (13 C), durchgeführt werden kann, Fluor-19 (F 19), etc., da kein Material durch NMR verbraucht im Gegensatz zu MS-Messungen.
Sowohl NMR-und MS kann in verschiedenen Modi verwendet werden, wobei jeder eine optimal für den Nachweis von Verbindungen mit bestimmten chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ist 31 P NMR oft besser als 1 H-NMR für die Analyse der mäßig konzentrierten phosphorylierten Verbindungen, obwohl fast alle phosphorylierten Metaboliten Protonen enthalten. Jedoch kann ihre 1 H-NMR-Signale durch 1 H-NMR-Signale von anderen, nicht-phosphorylierten Verbindungen verdeckt werden, während die letzterenoffensichtlich nicht dazu führen, Hintergrundsignale in 31 P-NMR-Spektren. In einer analogen Situation ist 19 F-NMR-Analyse für fluorierte Verbindungen, beispielsweise fluorierte Medikamente (keine Hintergrundsignale von endogenen Metaboliten) bevorzugt werden, während der Spezialfall von 13 C-NMR von Interesse fast ausschließlich wenn das Schicksal von 13 C markierten exogenen metabolischen Vorstufen muss beachtet werden, aufgrund der extrem niedrigen natürlichen Häufigkeit des Isotops 13 C (ca. 1%). Viele Massenspektrometer arbeiten entweder in Negativ-Ionen-Modus oder positiven Ionenmodus. Daher ist es wichtig, vor der Analyse, ob die Ionen beobachtet werden negativ oder positiv geladen sein kennen. Wir konzentrieren uns hier auf ein Protokoll für die Analyse von Hirngewebe Metabolom durch 1 H-und 31 P-NMR-Spektroskopie, da dieses Verfahren ergibt sich eine große Anzahl von wichtigen Metaboliten-Konzentrationen bei niedrigen Kosten in Form von (i) der Zeit für die Probenvorbereitung eine benötigtend (ii) Aufwand für Metabolit Quantifizierung erforderlich. Alle Experimente können unter Verwendung der Ausrüstung eines Standard-Nasschemielabor und einen hochauflösenden NMR-Spektroskopie-Anlage werden. Weitere Anforderungen sind in dem Protokoll weiter unten beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Tierethik RECHNUNG
Tierexperimentelle Studien an Ratten folgten die Leitlinien in Frankreich gültig ist, und wurden von der lokalen Ethikkommission (# 40.04, Universität Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankreich) genehmigt.
1. Ernte und Einfrieren Rattenhirn
- Vorbereitung erforderlich: flüssiger Stickstoff (N 2liq.) In Dewar, die groß genug, um ein Einfrieren Klemme (mindestens 2-3 l Volumen) zu halten, ist; Narkose (zB Isofluran oder Ketamin / Xylazin); Anästhesie Kammer; sterilen Sektions Werkzeuge: chirurgische Schere, Skalpell, Pinzette; Erfrischungstüchern und Flasche mit Reinigungsalkohol (Ethanol); Nadeln (25 g); 1 ml und 10 ml Spritzen. Label Aluminiumplatten (ca. 10 x 10 cm) mit Klebeband. Verwenden Sie Blätter, einzelne gefriereingespannten Rattenhirnen zu wickeln.
HINWEIS: Tragen Sie immer Schutzhandschuhe und Augenschutz Schutzbrille oder Maske beim Umgang mit flüssigem Stickstoff! - Füllen Dewar mit N 2liq. Und legen freizing Klemme in einem Dewar. Sicherstellen, dass die Menge an N in dem Dewar 2liq reicht für wiederholte Einfrier-Klemmverfahren (einige Liter, die Menge an N 2liq Verdampfen während jedes Gefrierspann hängt von der Größe der Klammer).
- Betäuben Tier (zB durch Isofluran oder durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin-Mischung). Gehen Sie zur Sterbehilfe durch Herzpunktion, um Blutungen zu verhindern, wenn die Kopfhaut wird entfernt und Schädel geöffnet wird. Schritte 1,4-1,7 unten beschreiben dieses Standardverfahren.
Hinweis: in speziellen Protokolle erfordern maximale Erhaltung von Glukose und Hochenergie-Metaboliten, Opfer Ratte von trichter Einfrieren des Gehirns des narkotisierten Tier mit N 2liq 11 nach dem Zurückziehen der Kopfhaut. Dann sezieren Gehirn aus dem Schädel unter intermittierender N 2liq auf Post-mortem-Stoffwechsel 12 zu minimieren. - Befeuchten Leiter der Ratte mit Reinigungsalkohol. Verwenden chirurgische Schere, um (i) remove Kopfhaut, und (ii) offenen Schädel entlang Schädelnähte.
- Verwenden einer Pinzette, um weitere Schädel zu öffnen und ganze Gehirn von der Unterseite des offenen Schädel zu entfernen, die Positionierung der Kopf auf den Kopf. Schnell zu entfernen, keine sichtbaren Spuren von Blut mit Erfrischungstüchern. Wenn Hemisphären metabolisch und morphologisch symmetrisch, ist es zweckmäßig, eine der Halbkugeln für metabolische Analyse nach der Trennung von der anderen Halbkugel durch Schnitt mit dem Skalpell. Falls erforderlich, verwenden Sie die restlichen Hemisphäre für andere Hirnstudien wie Histologie.
- Schnell zu entfernen, das Einfrieren von Klemme N 2liq -gefüllten Dewar, legen ganze oder halbe Rattenhirn auf einer Innenfläche, Klemme und sofort einfügen Einfrieren Klemme in N 2liq -gefüllten Dewar während Halteklammer fest zusammengedrückt. Stellen Sie sicher, dass die Schritte 1.3-1.6 nehmen nicht länger als 60 Sekunden.
- Nach 1-2 min entfernen Einfrieren Klemme aus dem Dewar, offene Klemme lösen gefrorenen Hirngewebe von Klemme, und Wrapgefrorene Gewebe in entsprechend gekennzeichneten Aluminiumblech (siehe 1.1 oben). Stellen Sie sicher, dass das Etikett lesbar ist und bleibt fest an seinem Platz, nachdem die Probe gewickelt. Stellen schnell verpackte Probe in N 2liq. Führen die gesamte Verfahren so schnell wie möglich zu dem Auftauen von gefrorenen Gehirngewebe zu vermeiden.
- Speichern gefrorene Probe in N 2liq oder in einem Gefrierschrank bei -80 ° C bis Metabolit Extraktion.
HINWEIS: Wenn eine biologische Probe, die auf mehr als ein Jahr gelagert werden, ist Lagerung bei N 2liq Temperatur auf über 80 ° C bevorzugt werden. Dies gilt auch für den Rest dieses Protokolls.
2. Vorbereitung des Metaboliten Extraktionsverfahren
- Vorbereitung Gewebehomogenisator und Anpassungsteströhrchen (beispielsweise 10 mm Innendurchmesser, je nach dem Durchmesser der Welle Homogenisator, üblicherweise aus Kunststoff). Verwenden Sie elektrische Homogenisatoren nicht manuell angetrieben Homogenisatoren (Gewebemühlen). Prepare Vortexer und Laborwaage.
- Bereiten Eimer mit zerstoßenem Eis gefüllt. Halten Sie ausreichend quantitites Methanol, Chloroform und Wasser auf Eis (4 ml pro Tier 250-350 mg gefrorenem Hirngewebe).
- Bereiten Pipetten und Fläschchen.
- Bereiten Glasfläschchen (≥20 ml Volumen) mit Schraubverschluss und auf Eis (eine Flasche pro Gewebeextrakt). Fit Schraubkappen mit einem Teflon-Septen resistent gegen Chloroform.
- Bereiten 5 ml Plastikpipetten zur Abgabe von Methanol und Wasser und Glaspipetten oder Hamilton-Spritzen zur Abgabe Chloroform. Bereiten Sie zusätzliche Kunststoffpipetten (5 oder 10 ml Volumen) für die Übertragung von Mischungen von Gewebehomogenat und Methanol.
- Stellen Sie sicher, alle Glaswaren gründlich mit destilliertem Wasser gespült und vor dem Gebrauch sorgfältig getrocknet, um Spuren von Verunreinigungen, insbesondere NMR detektierbaren Formiat und Acetat zu entfernen.
- Füllen Porzellanmörser mit N 2liq, Ort Porzellan Stößel im Mörser und füllen mit N 2liq. Stickstoff verdampft, bis die Temperatur von Mörser und Stößel ausreichend niedrig ist. Halten Sie kleine Menge von N 2liq in Mörtel.
3. Extraktion von Metaboliten
- Entfernen gefrorenen Gehirngewebeprobe aus dem Speicher (N 2liq Tank oder -80 ° C Tiefkühler). Dann sofort Gewebeprobe zu übertragen, um die teilweise mit N 2liq gefüllte Mörtel.
- Verwenden Sie die N 2liq -Kalte Stößel, um den gefrorenen Hirngewebe in kleinere Stücke, die leicht in die Teströhrchen für Gewebehomogenisierung verwendet passen zu brechen. Um Stücke von gefrorenem Gewebe aus, die aus der Mörtel in den Prozess projiziert zu verhindern, brechen die Gewebe, während sie noch in Aluminiumfolie umhüllt. Gefrorenen Gewebe mahlen nicht zu Pulver, da dies Übertragung in das Teströhrchen erschweren (erhöhtes Risiko von Kondenswasserbildung) zu machen. WICHTIG: Während der gesamten Prozedur, fügen N 2liq wie notwendig, um die Probe tiefgefroren zu halten, um Mörtel.
- Mix sMall Stücke von gefrorenem Hirngewebe gründlich, wiegen 250-350 mg und in ein Reagenzglas mit eiskaltem Methanol (4 ml für 250-350 mg Hirngewebe) gefüllt. Jedes Mal, wenn Stücke von gefrorenem Gewebe hinzu, homogenisieren diese sofort mit dem Gewebe-Homogenisator.
HINWEIS: Füllen Sie dieses gesamte Verfahren schnell auf die Probe, die zu einer Überschätzung der Probengewicht führen würde, und (ii) Heizung und Auftauen der Probe zu vermeiden (i) erhebliche Kondensation von Wasser. Einzelnen Gewebestücke sollten in gefrorenem Zustand bei Beginn der Homogenisierung werden. - Nachdem das letzte Stück des gefrorenen Rattenhirn Probe in das Teströhrchen und homogenisiert wurde hinzugefügt, übertragen Sie die Homogenat zu einem ≥20 ml Volumen Glasfläschchen, in der Nähe Schraubverschluss und lassen Sie stehen auf Eis für 15 min. Wenn das Volumen des Teströhrchens ist nicht ausreichend groß für ≥4 ml Methanol, mit einem kleineren Volumen Methanol, um einen Teil des gefrorenen Gehirngewebe homogenisiert, die Masse in derGlasfläschchen und weiter Homogenisieren der Restgewebestücke mit frischem Methanol. Stellen Sie sicher, dass der Gesamt Methanol Volumen 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe.
- Das gleiche Volumen eiskaltem Chloroform (dh 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe), um Homogenat, Vortex gründlich und lassen Sie stehen auf Eis für 15 min.
HINWEIS: Verwenden Sie stets belüftet chemischen Abzugshaube beim Umgang mit flüchtigen Lösungsmitteln, insbesondere Chloroform! - Das gleiche Volumen an Wasser (dh 4 ml pro 250-350 mg Hirngewebe), um Homogenat, Vortex gründlich und stehen lassen bei -20 ° C über Nacht.
4. Vorbereitung der Phasentrennung und Lösungsmittelverdampfung
- Bereiten kalten Zentrifuge (4 ° C, 13.000 g bei maximaler Radius) und Zentrifugenröhrchen. Sicherzustellen, dass die letzteren ≥20 ml Volumen, beständig gegen Chloroform und Fliehkräfte von 13.000 x g zu widerstehen. Verwenden Sie spezielle Glaszentrifugenröhrchen, sondern spülen (wie alle Glaswaren) mit destilliertem WasserVordergrund Verwendung (siehe 2.3).
- Bereiten Sie gründlich gespült Glas Pasteur Pipetten und eine entsprechende propipettor (Birne, manuellen Pipette Pumpe, automatischen Pipette Hilfe / Pipette, etc.).
- Vorbereitung weiterer zwei gründlich gespült Rohre (≥15 ml Volumen) pro Hirnprobe, die man braucht, beständig gegen Chloroform (aus Glas oder Teflon) sein, die andere zu Methanol (aus Kunststoff resistent gegen Methanol oder Glas).
- Bereiten Lösungsmittelverdampfung Gerät (im Handel erhältlich oder Eigenbau). Damit diese Vorrichtung eine fein gesteuert Strom aus trockenem Stickstoffgas, das auf der Oberfläche einer Extraktlösung, die flüchtige Lösungsmittel (Methanol, Chloroform) gerichtet ist.
- Bereiten Sie zwei zusätzliche Fächer oder Eimer mit Eis gefüllt: eine für den Probentransport auf Eis, und ein weiteres zur Aufbewahrung von Proben Kälte während des Verdampfungsprozesses.
- Vorbereitung Lyophilisator (Gefriertrockner) und Materialien für die Lyophilisation notwendig: (i) eine 50ml-Zentrifugenröhrchen oder Vakuum-Rundkolben pro Extrakt, und (ii) N 2liq um die wässrige Phase der Proben (≤0.3 L pro Probe) einzufrieren. Wenn Zentrifugenröhrchen verwendet wird, auch Weithalsflasche Vakuumfilter geeignet für Gefriertrocknungsanlage vorzubereiten.
5. Phasentrennung und Lösungsmittelverdampfung
- Für eine vollständige Phasentrennung, übertragen Sie die Methanol / Chloroform / Wasser / Hirn Gewebehomogenat (siehe 3.6) zu einer Chloroform-resistente Zentrifugenröhrchen (≥20 ml Volumen) und Zentrifuge bei 13.000 xg und 4 ° C für 40 min.
HINWEIS: Zwei Phasen zu bilden, von einer Schicht ausgefällte Protein abgetrennt. Die untere (schwerere) Phase aus Methanol, Chloroform und gelösten Lipide, während die obere (leichtere) Phase aus Wasser, Methanol und gelöste wasserlöslichen Metaboliten. - Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die obere Phase mit einem geeigneten ≥15-ml-Tube (Kunststoff resistent gegen Methanol, oder Glas) zu übertragen. Keep on ice.
- Verwenden Sie eine frische Pasteur-Pipette, um die untere Phase zu einer entsprechenden ≥15-ml-Tube (Glas oder Teflon) zu übertragen. Halten Sie auf dem Eis.
- Speichern der Schicht des ausgefällten Proteins bei -80 ° C, wenn es für die Bestimmung des Gesamtproteins zu verwenden ist; oder aber verwerfen.
- Halten des Rohres mit der Wasser / Methanol-Phase (siehe 5.2) auf Eis und Methanol zu verdampfen, indem man einen trockenen Stickstoffstrom auf die Oberfläche der Extraktionslösung. Alternativ sanft Blase Stickstoff durch die Extraktlösung. Beenden Sie den Verdampfungsprozess, wenn Einleiten von Stickstoff führt nicht mehr Volumenreduktion in der Extraktionslösung. Zu dieser Zeit, fahren Sie mit der Gefriertrocknung (siehe 5.7), oder einfrieren und halten Probe bei -80 ° C mit der Röhre geschlossen (Schraubverschluss oder Parafilm), bis sie zur Gefriertrocknung.
- Das Röhrchen mit dem Methanol / Chloroform-Phase (siehe 5.3) auf Eis und verdampfen Methanol durch Lenken eines trockenen Stickstoffstrom auf die sun-Schnittstelle der Extraktlösung. Wenn alle Lösungsmittel verdampft, den Prozess zu beenden und halten Sie die Probe bei -80 ° C mit der Röhre geschlossen (Schraubverschluss oder Parafilm), bis sie für die NMR-Analyse.
- Bereiten wässrigen Phase für Gefriertrocknung
- Nach dem Ende der Methanolverdampfungsprozess (siehe 5.5), übertragen Sie die Probe auf eine gründlich gespült 50 ml Zentrifugenröhrchen (wenn die Probe eingefroren ist, Tauwetter vor der Übertragung). Alternativ Transfer zu einem Vakuum-Rundkolben.
- Gefriertextraktlösung durch Drehen Zentrifugenröhrchen (oder Rundkolben) teilweise in N 2liq eingesetzt, daß die innere Oberfläche des Rohrs oder der Kolben wird nach und nach durch gefrorene Flüssigkeit bedeckt. Sicherzustellen, dass keine N 2liq. Kann die Aufnahme geben.
- Wenn die gesamte Flüssigkeit gefroren ist, decken Sie die Röhre mit einem Deckel oder punktiert Schraubverschluss, damit der Dampf entweichen, und legen Sie den Schlauch in einer Weithalsflasche Vakuumfilter.
- Starten Sie nach der Gefriertrocknung attaching der Kolben oder einer Flasche auf den Gefriertrockner.
- Beenden Sie den Gefriertrocknungsprozess, wenn die Probe vollständig trocken ist. Halten der Probe bei -80 ° C in einem geschlossenen Rohr (mit einem dichten Deckel!), Bis für die NMR-Analyse verwendet.
HINWEIS: In der Regel nicht mehr als 24 Stunden sind für die Gefriertrocknung benötigt. Mehrere Proben können gleichzeitig lyophilisiert werden, abhängig von der Konstruktion der Lyophilisator und ob Zentrifugenröhrchen in Weithalsflaschen oder Rundkolben verwendet.
6. Herstellung von NMR-Proben
- Speicher getrocknet und lyophilisiert Extrakte bei sehr niedriger Temperatur (≤ -80 ° C). Wieder aufzulösen Lyophilisate für die Vorbereitung der NMR-Proben unmittelbar vor NMR-Experiment.
HINWEIS: Lagerung von Proben in Lösung und / oder nahe der Raumtemperatur kann im Probenabbau führen! - Vorbereitung einer wässrigen 200 mM Lösung des Chelatbildners, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), wie folgt:
- Fügen Sie reines Wasser (zB 20 ml) in ein Reagenzglas oder Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie die Menge an Pulver CDTA notwendig, eine 200 mM Lösung zu generieren.
HINWEIS: Ein wesentlicher Teil der CDTA nicht löslich sein, da der pH-Wert ist sehr gering, da die Säureform CDTA wurde anstelle eines CDTA Salz verwendet. - Vorsichtig, Schritt für Schritt, immer größere Mengen von CsOH Pulver auf die CDTA Lösung und Wirbel nach jeder Zugabe gründlich.
HINWEIS: Die lösliche Fraktion CDTA mit zunehmender CsOH Gehalt in der wässrigen Lösung zu erhöhen. Vermeiden Sie "Übertitration", dh weniger hinzuzufügen als die stöchiometrische Menge CsOH auf die CDTA Lösung. - Wenn nahezu alle CDTA Pulver aufgelöst ist, beginnen die Messung von pH nach jeder CsOH hinaus und gründliche Verwirbelung. Beenden CsOH hinaus, wenn der endgültige pH-Wert erreicht wird (Tabelle 1).
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden alle CDTA gelöst werden. Die Verwendung von Cs + als Gegenion CDTA ist generüber Na + oder K + Verbündeten bevorzugt. Cs + ist eine weiche Lewis-Säure aufgrund ihrer großen Ionenradius, im Gegensatz zu Na + und K +, die kleineren Ionenradien aufweisen und starke Säuren. Folglich Cs + Komplexe mit Phosphaten (harte Basen) weniger leicht als dies Na + und K +. Dies ist für die 31 P-NMR-Spektroskopie von phosphorylierten Metaboliten von Vorteil, weil Komplex neigt dazu, NMR-Linienbreiten insbesondere unter den Bedingungen der langsame Zwischenionenaustausch zu erhöhen.
- Fügen Sie reines Wasser (zB 20 ml) in ein Reagenzglas oder Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie die Menge an Pulver CDTA notwendig, eine 200 mM Lösung zu generieren.
- 31 P-NMR-Analyse von Phospholipiden (PL), lösen getrockneten Lipide (siehe 5.6) in 700 ul eines Lösungsmittelgemisches aus deuteriertem Chloroform (CDCl 3), Methanol und CDTA-Lösung, hergestellt wie in 6.2 beschrieben (5: 4: 1 Volumenverhältnis). Die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Direkt Verschiebung (oder Verdrängungs) Mikropipette mit Chloroform-widerant-Tipps in beiden Schritten.
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Änderung einer der folgenden Parameter wird das Aussehen (chemische Verschiebung und Linienbreiten) von PL 31 P-NMR-Spektren 13-17 auswirken:
(I) Volumenverhältnis CDCI3: MeOH: CDTA Lösung
(Ii) Gesamtlösungsmittelvolumen verwendet
(Iii) pH-Wert der wässrigen Komponente des Lösungs
(Iv) CDTA Konzentration der wässrigen Komponente des Lösungsmittels.
HINWEIS: In der Regel die Feinabstimmung dieser Sample-Parameter (Tabelle 1) ist nicht notwendig und sollte mit äußerster Vorsicht, wenn in besonderen Fällen gewünscht durchgeführt werden. Ändern des Volumenverhältnis zwischen Lösemittel leicht zu der Bildung eines Systems, bestehend aus zwei Phasen statt einer homogenen Phase! Die Ein-Phasen-System wurde gefunden, daß praktischer als die Zwei-Phasen-System in den meisten Anwendungen 13,14. - Für 1 H-NMR-Analyse von wasserlöslichen Metaboliten, auflösen Lyophilisat (siehe 5.8) in 700 ul Deuteriumoxid (D 2 O), enthaltend 3-(Trimethylsilyl) propionsäure-2,2,3,3-d4 Natriumsalz (TSPD 4) im millimolaren Bereich (D 2 O, das 0,05% TSPD 4 ist im Handel erhältlich) . Die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Der pH-Wert der resultierenden wässrigen Extraktlösung auf 7,3 durch Zugabe von kleinen Mengen (ca. 2 ul) der Deuteriumchlorid (DCl) und Natrium deuteroxide (NaOD) Lösungen. Starten Sie zunächst mit 0,02 N DCl oder NaOD Lösungen. Wenn 2 oder 3 nachträglichen Erweiterungen nicht genügend pH-Änderung verursachen, mit 0,2 N DCl oder NaOD Lösungen fortzusetzen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu overtitrate.
HINWEIS: Die Gesamtmenge der DCl oder NaOD-Lösung benötigt wird, hängt von der Menge an Hirngewebe extrahiert wurde; beachten Sie diesen Wert für die präzise Quantifizierung Metabolit. In den meisten Fällen sollten die kombinierten Mengen der zugesetzten DCL und NaOD Lösungen praktisch vernachlässigbar ist (in der Nähe von 1% des NMR-Probenvolumen).
- Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie ein hochauflösendes Multikern-NMR-Spektrometer (≥9.4 Tesla Feldstärke, entsprechend 162 MHz 31 P, 400 MHz oder 1 H-Resonanzfrequenzen). Neben der Spule 31 P, sicherzustellen, dass die 31 P-NMR-Sonde besitzt eine Spule 1 H-Protonenentkopplung. Set Temperaturregelung der NMR-Sonde zum gewünschten Zielwert (in der Regel 25 ° C).
HINWEIS: Sondentemperatur muss 10-20 min zu stabilisieren! - Zentrifuge PL Extraktlösung in Mikrozentrifugenröhrchen (siehe 6.3) bei 4 ° C und 11.000 g für 30 min auf festen Rückstände in der Probe Spin-Down. Übertragen 600 ul des Überstands auf eine hochwertige NMR-Rohr (5 mm Außendurchmesser).
- Vorbereitung entsprechenden koaxialen Einsatzschaft mit einer wässrigen 20 mM Methylendiphosphonat (MDP)-Lösung bei pH 7,0 für die chemische Verschiebung Referenzierung gefülltenund Quantifizierung. Dieses Insert in der NMR-Röhrchen mit PL-Extrakt-Lösung gefüllt.
- Passen die NMR-Röhrchen mit dem entsprechenden Spinner und Transfer zum NMR-Magneten. Jetzt drehen die Probe bei 15-20 Hz und warten, bis die Probe auf die eingestellte Temperatur (ca. 10 min) eingestellt.
- Vorsichtig minimiert magnetische Feldinhomogenität in Probe durch Einstellen auf der Achse und außerhalb der Achse Shim Spulenströme 18.
- Set-NMR-Spektrum Erfassungsparameter auf optimale Werte, die als Funktion der Magnetfeldstärke (für einen 9,4 T System, siehe Tabelle 1 für empfohlene Parameterwerte) variieren kann.
- Legen Sie die Anzahl der Transienten pro Versuch (= NS).
- Set NS auf etwa 80 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 20 min), wenn nur die am weitesten verbreiteten PL sind mit Präzision quantifiziert werden (Phosphatidylcholin (PtdCho), Phosphatidylethanolamin (PtdEtn), Ethanolplasmalogen).
- Set NS etwa 100-200 (Gesamtlaufzeit von data Erwerb 1-2 h), wenn weniger konzentriert PLs werden quantifiziert werden (Alkyl-Acyl-Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure).
- Gesetzt, über NS 1500-2000 (Gesamtdauer der Datenerfassung 7-10 h; Nacht-Experiment), wenn sehr niedriger Konzentration PLs sind quantifiziert werden, zB Phosphatidylinositol Mono und Diphosphate (PtdIP und PtdIP 2), Cardiolipin, Lyso-PL , Alkyl-Acyl-Phosphatidylethanolamin und gelegentlich andere.
- Nach dem Ende des Spektrums Erfassung, Prozess Free Induction Decay (FID) mit optimierten Parametern. Die Werte dieser Parameter als Funktion der magnetischen Feldstärke, Shim Qualität und der PL-Signal zu quantifizieren.
- Um die besten Ergebnisse für den gesamten Bereich der PL erhalten, wiederholen Sie die Verarbeitung mit mehreren (mindestens zwei) verschiedene Filterverfahren. Verwenden Sie starke Auflösungssteigerung bei stark überlappenden Signalen, zB., Für PtdCho und PtdEtnRegionen.
- Verwenden Sie starke Filterung (schwache oder gar keine Erhöhung der Auflösung) für schwache Signale.
- Filter sehr schwach und breite Signale ohne erhebliche Überschneidungen von Apodization (zB LB = 3 Hz), um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, zB PtdIP und PtdIP 2 zu erhöhen. Siehe Tabelle 1 für charakteristische Verarbeitungsparameter.
- Quantifizierung der Fläche jeder PL-Signal in Bezug auf die Fläche unter dem Signal der Referenz-Verbindung (MDP) im gleichen Spektrum.
- Kalibrieren des Signals der Referenzverbindung (MDP) in einem separaten Experiment unter Verwendung eines 5 mm NMR-Röhrchens mit (i) einer Phosphorverbindung der bekannten Konzentration und (ii) die gleiche koaxiale Einsatzschaft in PL 31 P-NMR-Experimente eingesetzt gefüllt ( siehe 7.3 und 7.9).
- Berechnen einzelnen PL Konzentrationen basierend auf relativen Flächen PL Signale einerseits (siehe 7.9), und auf Kalibrierungswert für MDP erhalten ausKoaxial-Einsatz auf der anderen (siehe 7.10). Berücksichtigt, die die Anzahl der Phosphorkerne Beitrag zu einem bestimmten 31 P-NMR-Signal kann als eine Funktion der molekularen Ursprungs des Signals variieren.
HINWEIS: Der MDP Phosphonat Signal (üblicherweise 19,39 ppm referenziert) stellt zwei Phosphorkerne, wie die Phosphat-Cardiolipin-Signal. Alle anderen PL 31 P-NMR-Signale in Hirnextrakten nachgewiesen repräsentieren jeweils eine Phosphorkerns. - Statistik-Software verwenden, wie nötig, um Gehirn PL Ebenen zwischen Gruppen von Tieren zu vergleichen.
8. Leistung des 1 H-NMR-Experiment zur Analyse von wasserlöslichen Metaboliten Gehirn
- Set Temperaturregelung des 1 H NMR-Sonde zum gewünschten Zielwert (in der Regel 25 ° C). Bemerkungen siehe auch unter 7.1.
- Zentrifugieren Sie die Lösung in wässriger Extrakt Mikrozentrifugenröhrchen (siehe 6.5) bei 4 ° C und 11.000g für 30 min auf festen Rückstände in der Probe Spin-Down. Übertragen 600 ul des Überstands auf eine hochwertige NMR-Rohr (5 mm Außendurchmesser).
- Transfer-NMR-Röhrchen zu NMR-Magneten, Shim und setzen NMR-Spektrum Aufnahmeparameter auf die optimalen Werte wie in 7,4-7,6 erläutert. Siehe auch Tabelle 1 empfohlen für Parameterwerte.
- Die Anzahl der Transienten pro Experiment etwa NS = 32 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 13 min). Um einen guten Signal-Rausch-Verhältnisse für sehr schwache Signale, insbesondere im aromatischen Bereich zu erhalten, verwenden NS = 64 (Gesamtdauer der Datenerfassung ca. 26 min) oder mehr.
- Nach dem Ende des Spektrums Erfassung, Prozess Free Induction Decay (FID) mit optimierten Parametern. Die Werte dieser Parameter variieren leicht, als eine Funktion der magnetischen Feldstärke, Shim Qualität und des Metaboliten Signal zu quantifizieren.
HINWEIS: In den meisten Fällen reicht es aus, jedes Spektrums einmal verarbeitenUnd beschäftigt eine Reihe von Verarbeitungsparametern präsentiert einen guten Kompromiss für alle Stoffwechselsignale. Siehe Tabelle 1 für charakteristische Verarbeitungsparameter. - Quantifizierung der Fläche der einzelnen Metaboliten Signal (oft ein Multiplett, manchmal Überschneidungen mit anderen Slips oder Multipletts aus verschiedenen Molekülen stammen) in Bezug auf die Fläche unter dem Signal der Referenzverbindung (TSP-D-4) in der gleichen Spektrums.
- Berechnen einzelnen Metabolitenkonzentrationen basierend auf TSP-d 4-Konzentration (siehe 6.4). Berücksichtigt, die die Anzahl der Protonen Beitrag zu einer insbesondere 1 H-NMR-Signal kann als eine Funktion des Molekular Ursprung dieses Signals variieren. Die TSP-d 4 Trimethyl Signal (bis 0,0 ppm referenziert) stellt neun Protonen.
- Statistik-Software verwenden, wie nötig, um Hirnstoffwechselniveaus zwischen Gruppen von Tieren zu vergleichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um beste Auflösung bei Stoffwechsel NMR-Spektren von Gehirn und anderen Gewebeextrakten zu erhalten, ist es schon lange üblich, zu entfernen oder Maske Metallionen (vor allem: paramagnetischen Ionen) in Extraktlösungen vorhanden. Dies wurde entweder durch Zugabe eines Chelatbildners wie EDTA oder CDTA dem Extrakt 19, oder indem der Extrakt durch ein Ionenaustauschharz, wie Chelex-100 20 erreicht. Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser Schritt nicht für 1 H-NMR-spektroskopische Analyse erforderlich, wenn Hirnextrakten sorgfältig nach der obigen Vorschrift hergestellt. Hier wurden extrem schmalen Spektrallinien für alle Spektralbereiche, analysiert. Selbst in sehr gedrängten Bereiche, beispielsweise für Glutamin / Glutamat und myo-Inositol / Glycin, sind Peaks mit einem Abstand von <0,01 ppm fast bei 400 MHz (1, unten) vollständig trennbar sind. Als Folge qualitative,und quantitative Analyse der zahlreichen kleinen, aber momentan nicht zugewiesenen Peaks in der Mitte und Bodenplatten 1 sichtbar in der Zukunft in Betracht gezogen werden.
Abbildung 1. Unterregionen eines typischen 1 H-NMR-Spektrum (400 MHz) der wässrigen Phase einer Gehirngewebeextrakt aus einer weiblichen Lewis-Ratte. Alle drei Tafeln zeigen die extrem hohe Auflösung, erhältlich unter Verwendung der in dieser Veröffentlichung vorgestellt Protokoll. Weder Chelatbildner oder Ionenaustauschharz bei der Probenvorbereitung eingesetzt. Mitte und unten Tafeln zeigen die Existenz von vielen nicht zugeordneten Niederintensitätsspitzen, die an der großen Dynamikbereich durch hochauflösende 1H-NMR-Spektroskopie von Gewebeextrakten gedeckt, wenn unter Verwendung von optimierten Versuchsparameter weisen. Diese schwachen, aber gutdetektierbare Signale möglicherweise identifiziert und in der Zukunft zu quantifizieren. Mehrere nachgewiesenen Metaboliten spezifisch von Gehirngewebe, beispielsweise das Neuron Marker NAA oder Neurotransmitter GABA. Jedoch sind die meisten Verbindungen in einem breiten Spektrum von Stoffwechselwegen, die auf Säugerzellen gemeinsam sind, wie beispielsweise Aminosäure, verzweigtkettigen organischen Säure, Polyol (phospho) Lipid und Energiestoffwechsels sowie bei der Glykolyse und Glutaminolyse und beteiligt Funktionen wie Osmoregulation, Zellwachstum und Proliferation. Das Sternchen bezeichnet die Methyl-Resonanz aus einem Methanol Verunreinigung ergeben. Abkürzungen: Ala, Alanin; lac, Laktat; threo, Threonin; BHB, β-Hydroxybutyrat; val, Valin; ile, Isoleucin; Leu, Leucin; AAB, α-Aminobuttersäure; AHB, α-Hydroxybutyrat; tau, Taurin, scy -ins, scyllo Inositol; Myo -ins, Myo-Inositol; GPC, Glycerophosphocholin; PC, phosphocholine; cho, Cholin; crn, Kreatinin; Cr, Kreatin; GABA,47; -aminobutyrat; asp, Aspartat; NAA, N -acetylaspartate; Gln, Glutamin; glu, Glutamat; suc, Succinat; NANA, N -acetylneuraminate; ac, Acetat; Gly, Glycin. Die kleinen Peaks auf der Basis der Ala Dublett stammen aus der Laktat 13 C Satelliten Dublett (oberes Feld). Unter der Creative Commons Attribution License nachgedruckt (CCAL) Begriffen aus NW Lutz et al (2013) Cerebral biochemische Stoffwechselwege in experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis und Adjuvans-Arthritis:. Einer vergleichenden Studie metabolomische. PLoS ONE 8 (2):. E56101 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
In 31 P-NMR-Spektroskopie, Maskierung oder Entfernen von paramagnetischen Kationen (meist Eisen) ist zweifellos eine Notwendigkeit, weil Phosphate leicht Komplexe mit zwei-und dreiwertigen Ionen. Zugabe von CDTA Auszüge betrifft sowohl spektrale Linienbreiten eind chemischen Verschiebungen; Vergleichen Abbildung 2, oben und unten links. Linienverengung indem 1,000 mm (links unten) anstelle von 200 mM (oben links) CDTA war erwünscht, aber in Folge der Überlagerungssignale, die separat PL (oben links) quantifiziert werden soll. Daher wird 200 mM CDTA für die wäßrige Komponente des PL Lösungsmittel empfohlen, wobei alle anderen Bedingungen gleich sind. Darüber hinaus ist die Probentemperatur während der Messung beeinflusst spektralen Linienbreiten und die chemischen Verschiebungen; Vergleichen Abbildung 2, oben und rechts unten. Linienverengung durch die Wahl 277 K (unten rechts) anstelle von 297 K (oben rechts) war erwünscht, aber führte zu Überlagerung der Signale, die separat PL quantifiziert werden (oben rechts). Daher wird 297 K als Messtemperatur empfohlen, wobei alle anderen Bedingungen gleich sind. Vergleich zwischen den beiden Top-Panels zeigt, dass eine Abnahme der Konzentration von CDTA 200 mM (oben links) bis 50 mm (oben rechts) nur die Ergebnisse ineine bescheidene Zunahme der Linienbreite, und in fast keiner Veränderung in der chemischen Verschiebungen. Beachten Sie jedoch, dass die Gewebekonzentration in der 50 mM CDTA Extrakt ist halb so hoch wie in der 200 mM CDTA-Extrakt, erklärt die relativ schmale Linien in der rechten oberen Platte 13.
Abbildung 2. Phosphatidylethanolamin (PtdE) Regionen der Phospholipid-31 P-NMR-Spektren (162 MHz) von Hirngewebe Extrakte von weiblichen Lewis-Ratten (Top links) Hirngewebekonzentration, 236 mg / ml. CDTA Konzentration und pH-Wert in der wässrigen Komponente des Lösungsmittels, 200 mM und 7,33 sind; Messtemperatur, 297 K. PtdE Plasma und SM-Signale werden gut gelöst (unten links) Hirngewebekonzentration, 236 mg / ml. CDTA concentration und pH-Wert in der wässrigen Komponente des Lösungsmittels, 1,000 mM und 7,36 sind; Messtemperatur, überlappen 297 K. PtdE Plasma und SM-Signale vollständig; können sie nicht trotz reduzierter Linienbreite gelöst werden, im Vergleich mit der oberen linken Spektrum (oben rechts) Gehirn-Gewebekonzentration, 118 mg / ml. CDTA Konzentration und pH-Wert in der wässrigen Komponente des Lösungsmittels, 50 mM und 7,14 sind; Messtemperatur, 297 K. PtdE und SM-Signale werden gut aufgelöst (unten rechts) Gehirn-Gewebekonzentration, 118 mg / ml. CDTA Konzentration und pH-Wert in der wässrigen Komponente des Lösungsmittels, 50 mM und 7,14 sind; Messtemperatur, überlappen 277 K. PtdE und SM-Signale vollständig; sie kann nicht aufgelöst werden, trotz reduzierter Linienbreite im Vergleich mit der oberen rechten Spektrums. Abkürzungen: PtdE Plasma, Plasmalogen Ethanolamin; PtdE, Phosphatidylethanolamin; SM, Sphingomyelin; PTDs, phosphatidylserine; PTDC, Phosphatidylcholin. Mit Genehmigung von Lutz NW et al. (2010) Multiparameter-Optimierung von 31 P-NMR-spektroskopische Analyse von Phospholipiden in roher Gewebeextrakten nachgedruckt. 1. Chemische Verschiebung und Signaltrennung. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Unter Verwendung der oben Protokoll (Ein-Phasen-System 14; Abbildung 3, oben links), eine große Anzahl von quantifizierbaren PL nachgewiesen wurden (Abbildung 3, oben rechts), bedeckt eine erhebliche Konzentrationsbereich (beachten abgeschnittenen Hochintensitätssignale). Einige dieser Signale werden als noch nicht zugewiesen (U1, U2, U6). Wenn die Probenvorbereitung, NMR-Messung und Verarbeitung Spektrum durchgeführt werden, wie in diesem Protokoll angegeben, ist die spektrale Auflösung auch ausreichend, um routinemäßig derwähle Teilsplitting bestimmter Peaks (PTDs, PtdE, PtdE Plasma, AAPtdE, unten links). . Als Folge qualitative und quantitative Analyse von weiteren Untergruppen PL in der Zukunft ins Auge gefasst werden Abbildung 3, unten rechts, zeigt die Macht der umsichtig gewählt Verarbeitungsparameter teilweise getrennte Signale von niedriger Konzentration Verbindungen (hier: PtdC1u, eine PL abgeleitet von PTDC, die nicht vollständig identifiziert ist, und PTDC Plasma) Resonanz in der Nähe von sehr starken Signalen (hier: PTDC).
Abbildung 3. Phospholipid 31 P-NMR-Spektroskopie (162 MHz) von Hirngewebe Extrakte von weiblichen Lewis Ratten. (Top links) Ein Ein-Phasen-System (links) wurde über einen Zwei-Phasen-System (rechts) bevorzugt. Die am häufigsten verwendete Zweiphasensystem richtig behindertPL Quantifizierung, weil die meisten der oberen Phase befindet sich außerhalb des sensitiven Volumens der Spule befindet. (Oben rechts) fertig 31 P NMR-Spektrum von PL Rattenhirn. Für eine bessere Sichtbarkeit der schwachen Signale (PtdIP, PtdG), exponentielle Linienverbreiterung (LB = 3 Hz) wurde angelegt. In dieser Darstellung mehrere PL-Signale nicht gut aufgelöst, vor allem in den PTDC und PtdE Regionen. Für PLs erzeugen mehr als eine 31 P-NMR-Signal, werden beobachtet Kerne unterstrichen (P tdip, PTDI P, P tdip 2, PTDI P 2). Derzeit nicht zugeordnete Signale werden von "U n" (n = 1, 2, ...). (Unten links Platte) PtdE und PTDs Regionen des gleichen Spektrums bezeichnet. Für eine bessere Peak-Auflösung, Lorentz-Gauß-Linienform Transformation angewendet wurde (LB = -1 Hz, GB = 0,3). Aufgrund dieser Verfahrensparameter sind viele sehr schwache Signale PL schwer zu erkennen. Allerdings können mindestens zwei Peaksfür jeden PtdE, PtdE Plasma, AAPtdE und PTDs. (Unten rechts) PTDC Region mit den gleichen Verarbeitungsparameter wie die Region erhalten PtdE erkennen. Mehrere Signale auf der Basis der vorherrschenden Resonanz PTDC wurden eindeutig nachgewiesen, während sie sich nicht in der oberen Spektrum mit exponentiellen Linienverbreiterung (AAPtdC, PTDC Plasma PtdC1u) erzeugt erkennbar. Neben dem zurzeit unbelegt PTDC analog, PtdC1u, weitere kleinere Resonanzen können vorhanden sein von PTDC Hochfeld. Abkürzungen: PtdIP, Phosphatidylinositol Phosphat; PtdIP 2, Phosphatidylinositol Diphosphat; Ptda, Phosphatidinsäure; PtdG, Phosphatidylglycerin; CL, Cardiolipin; PtdE .., Summe der PtdE, PtdE Plasma und AAPtdE; PTDI, Phosphatidylinositol. Für weitere Abkürzungen siehe Legende zu Abbildung 2. Mit Genehmigung von Lutz NW et al Nachdruck. (2010) Multiparameter-Optimierung von 31 P-NMR-spektroskopische Analyse phospholipids in roher Gewebeextrakten. 1. Chemische Verschiebung und Signaltrennung. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Ernte und Einfrieren Rattenhirn | |||
| Dewar für N 2liq. Einfrieren Klemme (zB hausgemachte Wollenberger Zange, Lit. 1 und 2, unten von Tisch.); Anästhesie Kammer; chirurgische Schere; Skalpell; 500 ml Flasche mit Reinigungsalkohol | 1 von jeder | ||
| Zange | 2 | ||
| 1-ml-Spritze 10 ml-Spritze | 1 von jeweils pro Tier | ||
| 25 G Nadeln | 2 pro Tier | ||
| Probe VORBEREITUNGation | |||
| Typische Menge an Hirngewebe pro Extraktion | 250-350 mg | ||
| 350 mg Hirngewebe - MeOH Volumen in Homogenisieren 250 verwendet | 4 ml | ||
| 5 ml Plastikpipette | 3 pro Auszug | ||
| 10 ml Plastikpipette | 1 pro Auszug | ||
| Glasfläschchen (≥20 ml Volumen) | 1 pro Auszug | ||
| Chloroform-resistenten Zentrifugenröhrchen | 1 pro Auszug | ||
| Wartezeit nach Gewebehomogenisierung in MeOH (Mischung bei 4 ° C) | 15 min | ||
| Wasser und CHCl 3 Volumen von Hirngewebe in 4 ml MeOH homogenisiert | Jeweils 4 ml | ||
| Wartezeit nach dem Mischen homogenisiert Gewebe mit Wasser und CHCl 3 (Mischung bei -20 ° C) | über Nacht | ||
| Zentrifugation zur Trennung of wässrigen Extrakt aus Bio-Phase (Glaszentrifugenröhrchen) | 13.000 × g für 40 min bei 4 ° C | ||
| Konzentration CDTA Lösung (wässrige Phase Lösungsmittel-Gemisch zum Auflösen extrahierten Lipide) | 200 mM | ||
| pH-Wert der wässrigen Phase des Lösungsmittelgemisch zum Lösen extrahierten Lipide | 7.4 | ||
| Volumen-Verhältnis in Lipid-Lösungsmittel A für 31 P PL-Analyse verwendet (CDCl3: MeOH: CDTA Lösung) | 5: 4: 1 | ||
| Menge Lösungsmittel A verwendet, um Lipide aus 250 extrahiert auflösen - 350 mg Hirngewebe | 700 ul | ||
| Zentrifugation für Stillstand kommen, feste Teilchen in der NMR-Probe (Mikrozentrifugenröhrchen) | 11.000 × g für 30 min bei 4 ° C | ||
| pH-Wert der MR Probe mit wasserlöslichen Metaboliten | 7.3 | ||
| Probenvolumen NMR-Röhrchen überführt, nachdem Zentri- fugalkrugation | 600 ul | ||
| MDP Konzentration in koaxialer Einsatzschaft für 31 P-NMR | 20 mM | ||
| NMR-Experimente | |||
| Probentemperatur während der NMR-Experiment (bis zur Minimierung Spitzen Überlappung eingestellt werden) | 25 ° C | ||
| Spinnen Frequenz während NMR-Experiment | 15-20 Hz | ||
| 1 H-NMR-Aufnahmeparameter | |||
| Lösungsmittel bietet 2 H-Lock-Signal | D 2 O | ||
| Anregungsimpulsbreite P1 | 11 us | ||
| Anregungsimpuls, Verstärker Dämpfung, PL1 | 0 dB | ||
| FID Größe, TD | 32 k | ||
| FID Erwerb time, AQ | 3.283 sec | ||
| Entspannung Verzögerung, D1 | 15 Sekunden | ||
| Lösungsmittelunterdrückung Verzögerung, D4 | 6 sec | ||
| Gesamtwiederholungszeit TR | 24,3 sec | ||
| Spektrale Breite in ppm, SWP | 12.47 ppm | ||
| Spektrale Breite in Hz, SW | 4.990 Hz | ||
| Empfangsverstärkung, RG | 512 | ||
| Lösungsmittelunterdrückung (Dauerwelle) | CW | ||
| Lösungsmittelunterdrückung, Verstärker Dämpfung, PL9 | 50 dB | ||
| Anzahl der Transienten, NS | 32 oder 64 | ||
| 31 P-NMR-Aufnahmeparameter | |||
| Lösungsmittel bietet 2 H-Lock-Signal | CDCI3 | ||
| Anregungsimpuls width, P1 | 9.5 us | ||
| Anregungsimpuls, Verstärker Dämpfung, PL1 | 4 dB | ||
| FID Größe, TD | 16 k | ||
| FID Akquisitionszeit AQ | 2.019 sec | ||
| Entspannung Verzögerung, D1 | 15 Sekunden | ||
| Gesamtwiederholungszeit TR | 17 sec | ||
| Spektrale Breite in ppm, SWP | 25 ppm | ||
| Spektrale Breite in Hz, SW | 4.058 Hz | ||
| Empfangsverstärkung, RG (maximal) | 16.384 | ||
| Protonenentkopplung (Composite Puls Entkopplung) | CPD | ||
| Protonenentkopplung, Verstärker Dämpfung, PL13 | 19 dB | ||
| Anzahl der Transienten, NS | 1.500 oder 2.000 | ||
| NMR-Datenverarbeitung | 1 H-Resolution Enhancement, Gauß-Lorentz-Linienform Transformation | ||
| Gesamtbewertung Spektrum (bei Bedarf separat zu optimieren für einzelne Spektralbereiche, mit 0,1 <D <0,4 und -0,6 <LB <-0.2 Hz) | GB = 0,15, LB = -0.2 Hz | ||
| Sehr schwache Signale, zB aromatischen Säuren (alternativ mit LB ≥ 0,5 Hz Apodization) | GB = 0,015, LB = -0.3 Hz | ||
| Bereiche, die unter Gipfel: Verwendung Linienform passt für überlappende Resonanzen | |||
| 31 P Auflösungsverbesserung, Gauß-Lorentz-Linienform-Transformation | |||
| Gesamtbewertung der Spektrum (separat zu optimieren für einzelne Spektralbereiche, unter Verwendung von 0,05 <D <0,2 und -3,0 <LB <60; -1.0 Hz) | GB = 0,05, LB = -1.0 Hz | ||
| Sehr schwache Signale, zB PtdIP 2, Ptda: Apodization | LB = 3 Hz | ||
| Bereiche, die unter Gipfel: Verwendung Linienform passt für überlappende Resonanzen | |||
| Referenzen | |||
| 1. Palladino GW, Holz JJ, Proctor HJ. Geändert Gefrierspanntechnik für die Gewebetest. Das Journal der chirurgischen Forschung 289, 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [Eine einfache Technik für extrem schnelles Einfrieren von großen Gewebestücke]. Pflügers Archiv für Physiologie sterben Gesamte des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Tabelle 1. Versuchsparameter zur hochauflösenden 1 H und 31 P-NMR-Spektroskopie von GehirnGewebeextrakte. Typische Werte für die Volumenverhältnisse und Konzentrationen der Lösungsmittel und Reagenzien in den Gehirngewebeentnahme und NMR-Probenvorbereitung verwendet werden vorgestellt. Weitere empfohlene Werte beziehen sich auf pH-Wert und Temperatur-Messung sowie NMR-Erfassung und Verarbeitung Parameter zu probieren. Kleinere Anpassungen erforderlich sein, insbesondere wenn Protokoll wird auf andere als Hirngewebe aufgetragen. NMR-Parameter für die Messung bei 9,4 T optimiert und sollte für Spektrometer, die mit unterschiedlichen Magnetfeldstärken benötigt eingestellt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMR-Spektroskopie ist eine effiziente Methode zur Messung der Konzentration von chemischen Verbindungen in Lösung in einem sehr reproduzierbare und genaue Weise. Allerdings ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten es notwendig, bestimmte Vorschriften für die Probenvorbereitung und Analyse halten. Bei der Bestimmung der Metaboliten-Konzentrationen durch NMR-Spektroskopie, weder die Erzeugung noch der Empfang des NMR-Signals dominiert die Quantifizierungsfehler, sofern die Intensität des beobachteten Signals nähert sich die Detektionsschwelle (besonders schwaches Signal). In allen anderen Fällen biologische Variabilität der Probenpräparationstechnik (Extraktionseffizienz, physikalische und chemische Stabilität der Verbindungen, Pipettieren und Wiegefehler etc.) und / oder die Wahl der Signalerfassung und-verarbeitung Parameter Präzision und Genauigkeit der Ergebnisse zu bestimmen. Offensichtlich werden alle Stoffwechselveränderungen während der Gewebe Ernte auftretenden auch im Metabolitenkonzentrationen zu erhalten reflektiert werdenHrsg. Daher ist es sehr wichtig, Gewebe Ernte so schnell wie möglich abzuschließen, und auf bestimmte Gewebegefriertechniken wie Trichter Einfrieren wenn genaue in vivo-Konzentrationen schnell metabolisierenden Verbindungen gelten wichtig sind (vor allem Glukose, Laktat, ATP und seine Abbauprodukte ADP und AMP).
Selbst bei der Zwischenmagnetfeldstärke (9,4 T) einer Routine der hochauflösenden NMR-Spektrometers ausgezeichnete Spektren erhalten werden. Zum Beispiel wird in 1 H-NMR-Spektren der wässrigen Phase von Rattenhirnextrakten, Signale, deren Unterschied in der chemischen Verschiebung Δδ beträgt 0.005 ppm (entsprechend 2,0 Hz bei 400 MHz Resonanzfrequenz) ca. erkennbar und quantifiziert werden getrennt. Dies wird durch die teilweise Ablösung von (i) dem Lactat und Threonin-Dubletts und (ii) der Alanin-Dubletts von den kleinen Spitzen an seiner Basis (Lactat 13 C Satelliten Dublett dargestellt, Figur 1,oben). Spektrometer bei höheren Feldern (14,1 oder sogar 18,8 T) wäre Auflösung und Empfindlichkeit weiter zu erhöhen, obwohl diese Instrumente sind in der NMR-Labors weniger häufig aufgrund ihrer hohen Anschaffungskosten.
Unter Verwendung von 1 H-NMR-Spektroskopie kann eine breite Palette von Metaboliten gleichzeitig analysiert werden, dh in einem einzigen Akquisition. Die Empfindlichkeit des Experiments kann durch Erhöhung der Anzahl der akkumulierten Übergänge verbessert werden, obwohl diese Wahl die Messzeit erhöht sich proportional. (Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis proportional zur Quadratwurzel der Anzahl von Übergängen.) Da der maximale Gesamterfassungszeit in dem oben angegebenen Protokoll (20 - 30 min) sollte ausreichend sein, für nahezu alle Zwecke, sofern nicht der Betrag Gewebe für die Extraktion erhältlich ist sehr begrenzt. Neben die Nutzung der meisten NMR-sensitive Zellkern (Proton), hat metabolomische 1 H-NMR-Spektroskopie den Vorteil der umfassendenDatenbanken für unterschiedliche Feldstärken erhältlich und Proben pH-Werten 10. Weiterhin Software für automatische oder halbautomatische Auswertung Spektrum verfügbar geworden 10.
Während 1 H-NMR-Spektren von Gewebeextrakte können auch ohne Zusatz von Komplexbildnern aufgelöst wird, ist dies nicht mehr der Fall für 31 P NMR-Spektren. In der Tat, die Konzentration des Chelatbildners verwendet (zB EDTA oder CDTA) hat einen wesentlichen Einfluss sowohl auf die Linienbreite und der chemischen Verschiebung von 31 P-NMR-Signale von phosphorylierten Metaboliten ergeben. Erhöhung CDTA Konzentration in einem Extrakt nimmt 31 P-NMR-Linienbreiten, aber dieser Vorteil kann durch kleinere Unterschiede zwischen chemischen Verschiebungen, Δδ, von benachbarten Peaks aufgewogen werden. Daher ist die Menge an Chelatbildner verwendet wurde, um sowohl für die Linienbreite und der chemischen Verschiebung gemeinsam optimiert werden. Lipidextrakte, sind diese beiden spektralen Parameter significantly vom Gesamtprobenkonzentration beeinflusst, dh die Menge an Gewebe extrahiert, sondern auch durch den pH-Wert und der Temperatur der Probe während der NMR-Messung. Folglich muss jegliche Optimierung der Messbedingungen die kombinierten Effekte von allen beteiligten Versuchsparameter, einige dieser nicht additiv zu betrachten. Die Komplexität dieser Situation wird durch das Verhalten des PL 31 P-NMR-Spektren in Abbildung 2 gezeigt, veranschaulicht. Obwohl die untere Gewebekonzentration (118 mg / ml) wurde die niedrigste Temperatur (277 K) und die höchste Konzentration CDTA (1,000 mM) getestet würde niedrigsten Linienbreite führen, empfiehlt die vorgeschlagenen Protokoll die Verwendung von geringen Gewebekonzentration (236 mg / ml), Zwischen CDTA Konzentration (200 mM) und Raumtemperatur (297 K), um die Signal Überschneidungen zu vermeiden.
Obwohl die Bedingungen der Probenpräparation und Spektrenaufnahme sind von größter Bedeutung, dasRolle des Spektrums Verarbeitungsparameter bei der Gewinnung ein Maximum an Informationen aus den erfassten Rohdaten sollte nicht unterschätzt werden. Eine bestimmte Menge von Verarbeitungsparametern Mein ideal zum Detektieren und Quantifizieren von PLs, die in niedrigen Konzentrationen vorkommen; jedoch kann der gleiche Satz von Parametern einzelnen Peaks in "überfüllten" Spektralbereiche (Figur 3, oben rechts) zu verschleiern. Umgekehrt würde eine optimale Verarbeitungsparameter Auflösungsverbesserung in den Regionen der stark überlappenden Resonanzen (Abbildung 3, unten) machen Low-Intensitätsspitzen nicht nachweisbar. Die jüngsten Entwicklungen, darunter auch eine umfassende PL 31 P-NMR-Datenbank 13,14, die Analyse der NMR-Spektren 13,14 erheblich erleichtern.
Letztlich sind die Ziele der zugrunde liegenden Anwendung muss die Kriterien für die Optimierung, dh die gewünschte Balance der spektralen Auflösung, Empfindlichkeit, Präzision der Metabolit quantif zu definieren,ication, Geschwindigkeit und anderen Faktoren. Beispielsweise die empfohlenen Ein-Phasen-System für PL-Analyse erlaubt eine zuverlässige und effiziente PL Quantifizierung als Zweiphasensysteme (Abbildung 3, oben links), und eine hohe spektrale Auflösung und eine ausreichende Empfindlichkeit für die Quantifizierung von weniger reichlich PLs . In Fällen, in denen das beste Signal Trennung von viel höherer Priorität als eine effiziente und präzise Quantifizierung, die Verwendung eines höheren Prozentsatzes von Chloroform-d in der Lösungsmittelmischung kann versucht werden, obwohl dies führt leicht zur Trennung in der Abtastphase. Wenn dies der Fall ist, muss das Volumen der unteren Phase bestimmt die absolute PL Mengen erhalten werden (mg PL, pro g Gewebe oder mg Gesamtprotein).
In Proton-entkoppelte hetero NMR-Experimente können Signalintensitäten von Kern-Overhauser-Effekte (NOE) geändert werden, zusätzlich zu den aufgrund der schnellen Erwerb Systeme Sättigung. Wenn unkorrigiert diese Effekte führen zu Stoffwechsel quantitation Fehler. Es gibt zwei alternative Strategien, um mit dieser Herausforderung umzugehen. Im ersten Ansatz werden einzelne Transienten einer Übernahme durch lange Verzögerungen getrennt. Dieses Verfahren vermeidet jede Sättigung oder NOE aber führt zu relativ langen Experimenten; es sollte verwendet werden, wenn eine präzise und genaue Ergebnisse benötigt werden. In einigen Fällen kann die Priorität auf schnelle Frequenzerfassung bei sehr verdünnten Proben, die nur mit einer hohen Zahl von Übergängen gemessen werden kann, gegeben werden, im besonderen. In solchen Fällen würde Zugabe von paramagnetischen Entspannungsmittel zu der Probe eine schnelle Datenerfassung ohne Sättigung oder NOE ermöglichen. Alternativ kann eine schnelle Datenerfassung ohne Zugabe von paramagnetischen Mittel eingesetzt werden. Das letztere Verfahren erfordert Korrektur von Signalbereichen durch Korrekturfaktoren, die für jede NMR bestimmt werden, wohingegen die Anwesenheit von Entspannungsmitteln bewirkt eine Verbreiterung der NMR-Signale, die die Genauigkeit des Metaboliten für die Quantifizierung reduzieren kannfüllten Spektralbereich. Im allgemeinen ist die optimale Wahl der Versuchsbedingungen wird nicht nur durch den Probentyp diktiert, sondern auch durch die Informationen, die aus einem Experiment 13 extrahiert werden. Wenn eine hohe Priorität hat, um eine schnelle Analyse von Metaboliten nicht reichlich gegeben werden, ohne die Notwendigkeit für eine hohe Präzision und Genauigkeit, kann es ausreichen, um hochkonzentrierte Proben zu messen und zu verwenden kurze Wiederholungszeiten, gegebenenfalls mit paramagnetischen Entspannungsmittels zu der Probe hinzugefügt werden. Im Gegensatz dazu, wenn eine exakte Quantifizierung einer Vielzahl von Metaboliten ist wichtiger als die Geschwindigkeit, ist es bevorzugt, weniger konzentrierte Extrakte verwenden und lange NMR Erfassungszeiten zu akzeptieren, wie sie in der hier vorgestellten Protokoll demonstriert. Außerdem, wenn ein bestimmtes Forschungsprojekt unterstreicht spezifische Metaboliten, können Versuchsbedingungen angepasst werden, um optimale spektrale Auflösung für die spektralen Regionen in Frage zu erzielen. Das Protokoll und die Diskussion hier vorgestellten kann als Leitfaden für die o dienenptimization von Metabolom-Analyse des rohen Gewebeextrakten durch NMR-Spektroskopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E.
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
