ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

מודלים עכבריים כבר נוצלו בהרחבה בחקר מוח ^1. מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ נחקרו במוח עכבר וחולדה על ידי לימוד ביטוי גנים בRNA ו / או רמות חלבון מצד האחד, ופנוטיפים מורפולוגיים, תפקודיים, אלקטרו ו / או התנהגותי על ^2-6 האחר. עם זאת, כדי להבין את המנגנונים המקשרים פנוטיפ לגנוטיפ לחלוטין, זה הכרחי כדי לחקור את האירועים המולקולריים במורד הזרם של ביטוי חלבון, כלומר. חילוף החומרים של מצעים ביוכימיים שעליו אנזימים לפעול ^7. דרישה זו הובילה, על 10 עד 15 השנים האחרונות, לרנסנס של מחקר מטבולים בענפים רבים של ^8,9 ביולוגיה. בעוד שמחקרים מטבוליים קלאסיים פעמים רבות מתמקדים בפרטים של מסלולים ספציפיים, גישת metabolomic החדשה מיועדת לחקירה כוללנית של הפרופיל המטבולי הגלובלי של הרקמה תחת שיקול.אחת תוצאות של תפיסה זו היא צורך ברור לכלים אנליטיים שלמזער את ההטיה לכיוון מסלולי מטבוליים ספציפיים ו / או סוגי תרכובות. עם זאת, assay ביוכימיים קלאסי מבוסס על תגובה כימית מסוימת של אנליטי ספציפי שצריך להיות מוגדרים לפני assay מבוצע. בניגוד לכך, טכניקות ספקטרוסקופיות כגון תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה הגרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה (MS) (i) מבוססות על מאפיינים מסוימים מולקולריים (פיזיים) של תרכובות ביוכימיות, כל אחד מהם מעורר אותות אחד או כמה ברורים בספקטרום זוהה במהלך ניסוי אחד; וכן (ii) לזהות מספר רב של תרכובות שונות לכל ניסוי.

לפיכך, כל ספקטרום מכיל מידע המשולב של מגוון רחב של מטבוליטים כל. מסיבה זו, שיטות ספקטרוסקופיות הם כלים נאותים לmetabolomics, כמו שאף בחירה לפני צריכה להיעשות לגבי אופי אנליטי כדי להימדד ⁸ </sup>. כתוצאה מכך, הטכניקות הללו באופן טבעי להשאיל את עצמם ללימודי חיפושי נפט מכיוון שיקלו על זיהוי של שינויים מטבוליים בלתי צפויים במידה רבה.

למרות ספקטרוסקופיה NMR וMS ניתן להשתמש לסירוגין לניתוח מטבוליטים רבים, כל שיטה הוא בעל יתרונות וחסרונות לאחרונה כי נבדקו ¹⁰ ספציפיים. בקצרה, ספקטרוסקופיה NMR יכולה בדרך כלל להתבצע מתמציות גולמיים ואינה דורשת הפרדת chromatographic של תרכובות מדגם לפני הניתוח. בניגוד לכך, MS עובד עם גז או כרומטוגרפיה נוזלית (GC או LC) הפרדה, למעט התפתחויות מסוימות האחרונות כגון הדמיה ספקטרומטריית מסה. בכמה מקרים מיוחדים, כגון הניתוח של סוכרים, הפרדת LC עשויה להיות הכרח עבור ספקטרוסקופיה NMR, כמו גם, כי קווי התהודה של סוכרים שונים חופפים באופן משמעותי בפרוטון ⁽¹ H) NMR ספקטרום. אף על פי כן, ספקטרוסקופיה H NMR ¹ ללא chrהפרדת omatographic נשארה השיטה הפופולרית ביותר, כמעט אוניברסלי השימושית metabolomic NMR. באופן כללי, הכנת מדגם היא יותר זמן רב ומורכב עבור MS מאשר לספקטרוסקופיה NMR. בעיות חמורות בשל השפעות מטריצה ​​הן הרבה פחות נפוצות בספקטרוסקופיה NMR מאשר בטרשת הנפוצה שבו הם עלולים להוביל לאותות משמעותי מוחלשים. quantitation המטבוליט ניתן להשיג גם עם שיטה. עם זאת, תרכובות סטנדרטיים מרובות נדרשות עבור MS עקב שינויים בהשפעות מטריצה ​​ויעילות יינון בין מטבוליטים. לעומת זאת, רק אחד סטנדרטית לדגימה דרושה לניתוח ספקטרוסקופיות NMR כי בתנאי מדידה מתאימים, השיטה השנייה היא מהותית בזכות כמותיים לתגובת NMR ליניארי בקפדנות על ידי הגרעינים שנצפו. חסרון עיקרי של NMR הוא הרגישות הנמוכה יחסית שלה. MS, בLC-MS בפרט, הוא רגיש יותר מתמ"ג על ידי צווים שונים של גודל; מסיבה זו, הטרשת הנפוצה היא להיות מועדפת על פני NMR לניתוח של תרכובות המתרחשות בריכוזים נמוכים מאוד. מצד השני, הטבע הורסות של ניסוי NMR הוא יתרון ברור על פני MS; בדרך זו, ניתן לבצע NMR שוב ושוב על אותו המדגם, למשל, לגרעיני NMR פעיל שונים כגון ¹ H, זרחן 31 ב( ^{31 בP),} פחמן -13 (C ^13), פלואור-19 ⁽¹⁹ F) וכו '., כמו שאף חומר הנצרך על ידי NMR בניגוד למדידות MS.

יכולים להיות מועסק NMR וMS הן במצבים שונים, כל אחד מהם להיות אופטימלי לזיהוי של תרכובות עם מאפיינים כימיים מסוימים. לדוגמא, ^{ביום 31 בP} NMR הוא לעתים קרובות מתאים יותר ^מ1 H NMR לניתוח של תרכובות פוספורילציה מרוכזות במתינות, אם כי מטבוליטים כמעט כל פוספורילציה גם מכילים פרוטונים. עם זאת, ¹ אותות H NMR שלהם עשויים להיות מוסתרים על ידי ¹ אותות H NMR מתרכובות אחרות, שאינה פוספורילציה, ואילו האחרוניםברור שאתה לא לגרום לאותות רקע ^{ביום 31 בספקטרום} P NMR. במצב אנלוגי, ¹⁹ ניתוח F NMR יש להעדיף לתרכובות פלואור, למשל, תרופות פלואור (אין אותות רקע ממטבוליטים אנדוגני), ואילו במקרה המיוחד של ¹³ C NMR הוא עניין כמעט אך ורק אם גורלו של ¹³ C- מבשרי חילוף חומרים אקסוגניים שכותרת צריך להיות אחרי, בשל השפע הטבעי הנמוך מאוד של איזוטופ ¹³ C (בערך 1%). ספקטרומטרים המוניים רבים לעבוד במצב או יונים שליליים או במצב יון חיובי. לכן, חשוב לדעת מראש את הניתוח אם היונים כדי לצפות חיוב או לשלילה יחויבו. אנו מתמקדים כאן בפרוטוקול לניתוח metabolome רקמת המוח על ידי H ^{1 ויום 31 בספקטרוסקופיה} P NMR כי שיטה זו מניבה מספר גדול של ריכוזי המטבוליט חשובים בעלות נמוכה במונחים של זמן (i) דרוש למדגם הכנהnd (ii) מאמץ הנדרש כדי לכמת את המטבוליט. ניתן לבצע את כל הניסויים באמצעות הציוד של מעבדה כימיה רטובה סטנדרטית ומתקן ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה. דרישות נוספות המתוארים בסעיף הפרוטוקול להלן.

Protocol

הערה: מסר של בעלי החיים אתיקה מחקרים בבעלי חיים על חולדות ואחרי ההנחיות תקפות בצרפת, ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (# 40.04, אוניברסיטת בית הספר לרפואת Aix-Marseille, מרסיי, צרפת). .1 קצירה והקפאת מוח חולדה <li s…

Representative Results

כדי להשיג רזולוציה הטובה ביותר בספקטרום NMR חילוף חומרים של מוח ותמציות רקמות אחרות, זה כבר זמן רב מנהג נפוץ כדי להסיר או יוני מסכת מתכת (הכי חשוב: יוני פאראמגנטיים) קיימים בפתרוני תמצית. זו הושגה על ידי הוספת סוכן chelating כגון EDTA או CDTA לתמצית 19, או על ידי העברת התמצית…

Discussion

ספקטרוסקופיה NMR היא שיטה יעילה למדידת ריכוזים של תרכובות כימיות בפתרון בצורה מאוד לשחזור ומדויק. עם זאת, כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה יש צורך לדבוק בכללים מסוימים הנוגעים להכנת מדגם וניתוח. בקביעת ריכוזי המטבוליט ידי ספקטרוסקופיה NMR, לא הדור ולא הקבלה של אות NMR שולטת ?…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913