Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

Modelos murinos têm sido utilizados extensivamente em pesquisas sobre o cérebro ^1. Correlações genótipo-fenótipo foram investigados em ratinhos e ratos cérebros por estudar a expressão do gene no RNA e / ou os níveis de proteína em, por um lado, e os fenótipos morfológicos, funcionais, electrofisiológicos e / ou comportamentais no outro ^2-6. No entanto, para compreender completamente os mecanismos que ligam fenótipo com o genótipo, é imperativo para investigar os eventos moleculares jusante da expressão da proteína, ie. o metabolismo dos substratos bioquímicos sobre o qual as enzimas actuam ^7. Esta exigência levou, ao longo dos últimos 10 a 15 anos, a um renascimento da pesquisa metabólica em muitos ramos da biologia ^8,9. Enquanto estudos metabólicos clássicos têm sido muitas vezes focado em detalhes de caminhos específicos, a nova abordagem metabolômica é voltada para uma investigação abrangente do perfil metabólico global do tecido em questão.Uma conseqüência desse conceito é uma necessidade óbvia de ferramentas analíticas que minimizem viés para as vias e / ou classes de compostos metabólicos específicos. No entanto, um ensaio bioquímico clássica baseia-se numa reacção química específica de um analito específico que precisa de ser especificado antes de o ensaio é realizado. Por outro lado, as técnicas espectroscópicas de ressonância magnética (RMN) nuclear e espectrometria de massa (MS) (i) são determinadas com base em propriedades moleculares (físicas) de compostos bioquímicos, cada um dos quais dá origem a um ou vários sinais distintos num espectro detectado no decurso de uma experiência; e (ii) detectar um grande número de compostos diferentes por experiência.

Assim, cada espectro contém a informação combinada de toda uma gama de metabolitos. Por esta razão, métodos espectroscópicos são ferramentas adequadas para metabolômica, já que nenhuma seleção prévia precisa ser feita em relação à natureza da substância a medir ⁸ </sup>. Como consequência, estas técnicas adequam-se naturalmente para estudos exploratórios porque facilitam grandemente a detecção de alterações metabólicas inesperados.

Embora espectroscopia de RMN e MS pode ser utilizada indiferentemente para a análise de vários metabolitos, cada método possui vantagens e desvantagens que foram recentemente revisto ¹⁰ específicas. Resumidamente, a espectroscopia de RMN pode geralmente ser realizada a partir de extractos em bruto e não necessita de separação cromatográfica de compostos de amostra antes da análise. Por outro lado, MS trabalha com gás ou cromatografia líquida (GC ou LC) separação, exceto para os recentes desenvolvimentos específicos, tais como imagens de espectrometria de massa. Em alguns casos especiais, tais como a análise de açúcares, LC separação pode tornar-se uma necessidade para a espectroscopia de RMN, como bem, porque as linhas de ressonância de diferentes açúcares sobrepõem-se significativamente em protão ^(1H) Os espectros de RMN. No entanto, ^uma espectroscopia de RMN sem chrseparação omatographic continua a ser o método de RMN mais popular, quase universalmente aplicada metabolômica. Geralmente, a preparação da amostra é mais demorada e complexa para MS do que para espectroscopia de RMN. Sérios problemas devido a efeitos de matriz são muito menos comuns em espectroscopia de RMN que em MS, onde eles podem levar a sinais consideravelmente atenuados. Metabolito quantificação pode ser conseguida com um ou outro método. No entanto, vários compostos padrão são necessários para a MS, devido às variações nos efeitos de matriz e as eficiências de ionização entre os metabolitos. Pelo contrário, apenas um padrão por exemplo é necessário para uma análise de espectroscopia de RMN, porque sob as condições de medição adequadas, o último método é intrinsecamente graças quantitativos para a resposta RMN estritamente linear pelos núcleos observados. Uma grande desvantagem de RMN é a sua sensibilidade relativamente baixa. MS, em particular, LC-MS, é mais sensível do que a RMN de várias ordens de grandeza; por esta razão, MS é para ser preferido sobre RMN para oanálise de compostos que ocorrem em concentrações muito baixas. Por outro lado, a natureza não destrutiva da experiência de RMN é uma clara vantagem sobre a esclerose múltipla; desta forma, pode ser realizada RMN repetidamente com a mesma amostra, por exemplo, para diferentes núcleos de RMN-activo, tal como ^um H, fósforo-31 ⁽³¹ P), carbono-13 ⁽¹³ C), flúor-19 ⁽¹⁹ M) etc., como nenhum material é consumido por RMN em oposição às medições de MS.

Tanto a RMN e MS pode ser utilizada em modos diferentes, cada um sendo óptima para a detecção de compostos com características químicas específicas. Por exemplo, ³¹ P RMN é muitas vezes mais adequados do que ¹ H RMN para a análise de compostos fosforilados moderadamente concentrado, embora quase todos os metabólitos fosforilados também contêm protões. No entanto, os sinais de ¹ H NMR pode ser obscurecido por sinais de ¹ H RMN de outros compostos, não fosforilada, enquanto o segundoobviamente não causam sinais de fundo em ³¹ P espectros de RMN. Em uma situação análoga, ¹⁹ F NMR análise é para ser preferido para os compostos fluorados, por exemplo, drogas fluorados (não há sinais de fundo de metabolitos endógenos), enquanto que o caso ^especial, de ¹³ C RMN de interesse é, quase exclusivamente, se o destino do ^13C precursores metabólicos marcados exógenos deve ser seguido, devido à extremamente baixa abundância natural dos isótopos de ¹³ C (cerca de 1%). Muitos espectrómetros de massa de funcionar no modo de iões negativos ou modo de ião positivo. Portanto, é importante saber em frente da análise se os iões a serem observados são negativamente ou positivamente carregada. Nós nos focamos em um protocolo para a análise do tecido cerebral metabolome por ¹ H e ³¹ P espectroscopia de RMN, porque este método produz um grande número de concentrações metabólicas importantes, a baixo custo, em termos de (i) tempo necessário para a preparação de amostras dend (ii) esforço necessário para o metabolito quantificação. Todos os ensaios podem ser realizados utilizando o equipamento de laboratório padrão de química húmida e uma maior facilidade de resolução espectroscopia de RMN. Outros requisitos estão descritos na seção de protocolo a seguir.

Protocol

NOTA: ANIMAL DE ÉTICA DECLARAÇÃO Os estudos em animais em ratos seguiu as diretrizes válidas na França, e foram aprovados pelo Comitê de Ética local (# 40.04, da Universidade de Aix-Marseille Medical School, Marselha, França). 1. colheita e congelamento de cérebro de rato Prepare os itens necessários: nitrogênio líquido (2liq N.) Em Dewar que é grande o suficiente para manter a braçadeira de congelamento (pelo menos 2-3 L volume); anestésico (p…

Representative Results

Para obter melhor resolução em espectros de RMN metabólica do cérebro e outros extratos de tecidos, tem sido prática comum para remover ou íons máscara de metal (o mais importante: íons paramagnéticos) presentes em soluções de extractos. Isto foi conseguido através da adição de um agente quelante tal como o EDTA ou o extracto de CDTA 19, ou fazendo passar o extracto através de uma resina de troca iónica, tais como Chelex-100 20. Os resultados apresentados na Figura 1</strong…

Discussion

Espectroscopia de RMN é um método eficiente para a medição de concentrações de compostos químicos em solução de um modo muito preciso e reprodutível. No entanto, a obtenção de dados de alta qualidade, é necessário obedecer a certas regras respeitantes à preparação e análise de amostras. Na determinação das concentrações do metabolito por espectroscopia de RMN, nem a geração ou a recepção do sinal de RMN domina o erro de quantificação, a menos que a intensidade de um sinal observado se aproxim…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913