ऊतक अर्क के उच्च संकल्प परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा चूहे के मस्तिष्क के Metabolomic विश्लेषण
Summary
The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).
Abstract
Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.
Introduction
Murine मॉडल मस्तिष्क अनुसंधान 1 में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है. जीनोटाइप-phenotype सहसंबंध अन्य 2-6 पर एक हाथ पर शाही सेना और / या प्रोटीन के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करके माउस और चूहे के दिमाग में जांच की, और, रूपात्मक कार्यात्मक, electrophysiological और / या व्यवहार phenotypes किया गया है. हालांकि, पूरी तरह से जीनोटाइप के लिए फेनोटाइप जोड़ने तंत्र को समझने के लिए, यह नीचे की ओर प्रोटीन अभिव्यक्ति, यानी की आणविक घटनाओं की जांच के लिए जरूरी है. एंजाइमों 7 कार्य जिस पर जैव रासायनिक substrates के चयापचय. इस आवश्यकता को जीव विज्ञान 8,9 की कई शाखाओं में चयापचय अनुसंधान के पुनर्जागरण के लिए, पिछले 10 से 15 वर्षों में, का नेतृत्व किया. शास्त्रीय चयापचय अध्ययन अक्सर विशिष्ट रास्ते में से विवरण पर ध्यान केंद्रित किया गया है, वहीं नए metabolomic दृष्टिकोण विचाराधीन ऊतक के वैश्विक चयापचय प्रोफाइल के एक सब को शामिल जांच की दिशा में सक्षम है.इस अवधारणा का एक परिणाम यह विशिष्ट चयापचय मार्ग और / या यौगिकों की कक्षाओं के प्रति पूर्वाग्रह कम से कम कि विश्लेषणात्मक उपकरणों के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है. हालांकि, एक शास्त्रीय जैव रासायनिक परख परख प्रदर्शन किया है से पहले निर्दिष्ट करने की आवश्यकता है कि एक विशिष्ट analyte की एक विशेष रासायनिक प्रतिक्रिया पर आधारित है. इसके विपरीत, इस तरह के परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) (क) के रूप में स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक जैव रासायनिक यौगिकों, का विशेष आणविक (शारीरिक) गुणों के आधार पर कर रहे हैं, जिनमें से प्रत्येक एक स्पेक्ट्रम में एक या कई अलग संकेतों को जन्म देता है एक प्रयोग के पाठ्यक्रम में पाया; और (ii) प्रयोग प्रति अलग यौगिकों की एक बड़ी संख्या का पता लगा.
इस प्रकार, प्रत्येक स्पेक्ट्रम मेटाबोलाइट्स की एक पूरी रेंज के संयुक्त जानकारी है. कोई पूर्व चयन विश्लेष्य की प्रकृति के बारे में 8 मापा जा करने के लिए किए जाने की आवश्यकता के रूप में इस कारण से, स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों metabolomics के लिए पर्याप्त उपकरण हैं, </sup>. वे बहुत अप्रत्याशित चयापचय परिवर्तनों का पता लगाने की सुविधा है, क्योंकि एक परिणाम के रूप में, इन तकनीकों स्वाभाविक रूप खोजपूर्ण अध्ययन करने के लिए खुद को उधार दे.
एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और एमएस कई मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रत्येक विधि विशिष्ट फायदे और हाल ही में 10 की समीक्षा की गई है कि नुकसान के पास. संक्षेप में, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी आमतौर पर कच्चे तेल के अर्क से किया जा सकता है और विश्लेषण से पहले नमूना यौगिकों की chromatographic जुदाई की आवश्यकता नहीं है. इसके विपरीत, एमएस ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के रूप में विशेष रूप से हाल के घटनाक्रम के अलावा, गैस या तरल क्रोमैटोग्राफी (जीसी या नियंत्रण रेखा) जुदाई के साथ काम करता है. विभिन्न शर्करा की गूंज लाइनों (1 एच) एनएमआर स्पेक्ट्रा प्रोटॉन में काफी ओवरलैप क्योंकि ऐसे शर्करा के विश्लेषण के रूप में कुछ विशेष मामलों में, नियंत्रण रेखा जुदाई, साथ ही एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक आवश्यकता बन सकता है. CHR बिना फिर भी, 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपीomatographic जुदाई सबसे लोकप्रिय, लगभग सार्वभौमिक एप्लाइड metabolomic एनएमआर विधि बनी हुई है. आम तौर पर, नमूना तैयार यह एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए है की तुलना में एमएस के लिए और अधिक समय लेने वाली और जटिल है. मैट्रिक्स प्रभाव के कारण गंभीर समस्या ज्यादा वे काफी तनु संकेतों को जन्म दे सकती है, जहां एमएस में से एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी में कम आम हैं. Metabolite quantitation या तो विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, कई मानक यौगिकों के कारण मेटाबोलाइट्स के बीच मैट्रिक्स प्रभाव और आयनीकरण क्षमता में बदलाव करने के लिए एमएस के लिए आवश्यक हैं. इसके विपरीत, नमूना प्रति केवल एक मानक क्योंकि उपयुक्त मापने परिस्थितियों में एक एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक है, बाद विधि आंतरिक रूप से मनाया नाभिक से सख्ती से रेखीय एनएमआर प्रतिक्रिया के लिए मात्रात्मक धन्यवाद है. एनएमआर की एक बड़ी खामी इसकी अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता है. एमएस, विशेष रूप से नियंत्रण रेखा एमएस में, परिमाण के कई आदेशों द्वारा एनएमआर तुलना में अधिक संवेदनशील है; इस कारण से, एमएस के लिए एनएमआर अधिक पसंद किया जा रहा हैबहुत कम मात्रा में होने वाली यौगिकों का विश्लेषण. दूसरी ओर, एनएमआर प्रयोग के nondestructive प्रकृति एमएस पर एक स्पष्ट लाभ है; इस तरह, एनएमआर ऐसे 1 एच, फास्फोरस-31 (31 पी), कार्बन -13 (13 सी) के रूप में विभिन्न एनएमआर सक्रिय नाभिक के लिए, जैसे ही नमूना, पर बार बार प्रदर्शन किया जा सकता फ्लोरीन -19 (19 एफ) आदि., एमएस माप के लिए विरोध के रूप में कोई सामग्री एनएमआर द्वारा सेवन किया जाता है के रूप में.
एनएमआर और एमएस दोनों अलग मोड में नियोजित किया जा सकता है, हर एक विशेष रासायनिक गुणों के साथ यौगिकों का पता लगाने के लिए इष्टतम किया जा रहा है. लगभग सभी phosphorylated मेटाबोलाइट्स भी प्रोटॉन होते हैं, हालांकि उदाहरण के लिए, 31 पी एनएमआर, अक्सर मामूली केंद्रित phosphorylated यौगिकों के विश्लेषण के लिए 1 एच एनएमआर से बेहतर अनुकूल है. हालांकि, उनके 1 एच एनएमआर संकेतों जबकि बाद, अन्य, गैर phosphorylated यौगिकों से 1 एच एनएमआर संकेतों से छिप जा सकता हैजाहिर है 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा में पृष्ठभूमि संकेतों का कारण नहीं है. 13 सी एनएमआर का विशेष मामला लगभग विशेष रूप से ब्याज की है, जबकि एक अनुरूप स्थिति में, 19 एफ एनएमआर विश्लेषण, fluorinated यौगिकों, जैसे, fluorinated दवाओं (अंतर्जात मेटाबोलाइट्स से कोई पृष्ठभूमि संकेत) के लिए पसंद किया जा रहा है तो 13 सी के भाग्य लेबल बहिर्जात चयापचय व्यापारियों कारण 13 सी आइसोटोप (सीए 1%) के बहुत कम प्राकृतिक बहुतायत के लिए, का पालन किया जाना चाहिए. कई मास स्पेक्ट्रोमीटर नकारात्मक आयन मोड या सकारात्मक आयन मोड या तो में काम करते हैं. इसलिए, यह आगे आयनों नकारात्मक या सकारात्मक चार्ज कर रहे हैं मनाया जा चाहे विश्लेषण के बारे में पता करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस विधि नमूना तैयार करने के लिए एक के लिए आवश्यक (मैं) समय के संदर्भ में कम लागत में महत्वपूर्ण metabolite सांद्रता की एक बड़ी संख्या पैदावार क्योंकि हम 1 एच और 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों metabolome के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल पर यहाँ ध्यान केंद्रितएन डी (द्वितीय) प्रयास metabolite quantitation के लिए जरूरी है. सभी प्रयोगों एक मानक गीला रसायन विज्ञान प्रयोगशाला के उपकरण और एक उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी सुविधा का उपयोग किया जा सकता है. आगे की आवश्यकताओं नीचे प्रोटोकॉल खंड में वर्णित हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और सही ढंग से समाधान में रासायनिक यौगिकों की सांद्रता को मापने के लिए एक कारगर तरीका है. हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support by Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) is gratefully acknowledged.
Materials
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15-mL, 30-mL tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10-mL volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96 % deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96 % deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20 % in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30 % in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
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