Olfaktoriske Neuroner opnået ved nasal biopsi Kombineret med Laser-Capture mikrodissektion: En Potentiel tilgang til Uddannelse behandlingsrespons i Mental Disorders

Summary

I denne undersøgelse en ny platform undersøge intraneuronale molekylære underskrifter af behandlingsrespons ved bipolar sygdom (BD) blev udviklet og valideret. Lugteepitel fra BD patienter blev opnået gennem nasale biopsier. Så laser-capture mikrodissektion blev kombineret med Real Time RT-PCR til at undersøge den molekylære signatur af lithium respons i BD.

Abstract

Bipolar lidelse (BD) er en alvorlig neuropsykiatrisk lidelse med dårligt forstået patofysiologi og typisk behandlet med stemningen stabilisator, lithiumcarbonat. Dyreforsøg samt humane genetiske undersøgelser viser, at lithium påvirker molekylære mål, der er involveret i neuronal vækst, overlevelse og modning, og især molekyler involveret i Wnt signalering. I betragtning af den etiske udfordring at opnå hjernen biopsier for at undersøge dynamiske molekylære ændringer er forbundet med lithium-respons i det centrale nervesystem (CNS), kan man overveje at anvende neuroner opnået fra olfaktoriske væv for at nå dette goal.The lugteepitel indeholder olfaktoriske receptor neuroner på forskellige stadier af udvikling og glia-lignende støtte celler. Dette giver en unik mulighed for at studere dynamiske ændringer i CNS af patienter med neuropsykiatriske sygdomme, ved hjælp af olfaktoriske væv sikkert fås fra nasale biopsier. For at overvinde den ulempe udgøres af substantial forurening af biopsi olfaktoriske væv med ikke-neuronale celler, blev en ny tilgang for at opnå berigede neuronal cellepopulationer udviklet ved at kombinere nasale biopsier med laser-capture mikrodissektion. I denne undersøgelse blev et system til undersøgelse behandlingsrelaterede associeret dynamiske molekylære forandringer i neuronvæv udviklet og valideret ved hjælp af en lille pilot prøve af BD patienter rekrutteret til studiet af de molekylære mekanismer i lithium behandlingsrespons.

Introduction

Bipolar lidelse (BD) er en alvorlig neuropsykiatrisk lidelse, karakteriseret ved patologiske ændringer i humør, drive og kognition ^1. Lithium anvendes til behandling af BD har vist sig at ændre steady state mRNA niveauer af et stort antal gener i dyreforsøg ^2, men det er uvist, om nogen af disse molekyler er forbundet med klinisk respons hos mennesker ^2. Forståelse mekanismen af ​​lithium reaktion ville kræve undersøgelse lithium-induceret molekylære ændringer i neuronale væv. Desværre er det ikke praktisk at få hjernen biopsier af BD patienter før og efter lithium terapi for at identificere molekylære signaturer af lithium respons. Post-mortem hjernevæv er blevet anvendt til at undersøge biomarkører i BD, men de kan ikke anvendes til at vurdere molekylære markører forbundet med dynamiske ændringer i følelser, kognition og drev; og gyldigheden af efterfølgende konstateret lithium behandlingsrespons kan være problematisk ⁴. Lymfocytter og andre blodceller kan være nyttige, men molekylære ændringer i blodcellerne kan afvige neuronal ændringer ^3-5. Cerebrospinalvæske kan være utilstrækkelig til at indhente oplysninger om intracellulære molekyler, som kan afspejle sygdomsassocierede og medicin-reversibel iboende forandringer.

Lugteepitelet (OE) er en unik del af det centrale nervesystem (CNS), embryologisk relateret til limbiske strukturer ^6; og det er let tilgængeligt via nasal biopsier. Den består af glial-lignende støtte (dvs. sustentacular) celler basal prolifererende celler og olfaktoriske receptor neuroner på forskellige stadier af udvikling ^7-9. Derfor OE giver en enestående mulighed for at accessibly studere dynamiske ændringer i CNS af patienter med neuropsykiatriske sygdomme ^7. Undersøgelser demonstrerer anvendeligheden af ​​OE som surrogat væv til undersøgelse af sygdoms- forbundet begivenheder, der afspejler disse OCCurring i hjerneneuroner ^8,9. For eksempel har undersøgelser udnyttes OE for at undersøge molekylære profiler forbundet med psykiatriske lidelser ^10-14. Lugtesystemet også tjener til at identificere kliniske endophenoytpes såsom lugt underskud, der er forbundet med de negative symptomer på skizofreni ^15. Derudover fortsætter neurologiske processer i OE gennem hele livet, der giver et nyttigt avenue at modellere den underliggende patofysiologi psykiatriske tilstande ^8,9.

Men en ulempe ved anvendelsen af dette væv er den betydelige forurening af olfaktoriske biopsier med ikke-neuronale celler ^16. For eksempel total RNA anvendes til genekspressionsstudier i tidligere OE undersøgelser indeholdt RNA ekstraheret fra hele nasal biopsi væv, herunder RNA fra ikke-neuronale celler ^17. Derfor har de tidligere metoder været begrænset af kvaliteten af ​​celler. For at overvinde dette problem, at en ny tilgang opnå berigede neuronale cellepopulationer ved at kombinere nasale biopsier med laser-capture mikrodissektion (LCM) er blevet udviklet ^18.

LCM er en teknik, der giver mulighed for selektiv isolering af celler under anvendelse af UV laserskæring kombineret med infrarød laser ^19-21. Kombinere LCM med OE tilgang minimerer væsentlig forurening af OE af ikke-neuronale celler og dermed øge berigelse af neuronale celler ^18. Desuden kan den neuronale lag adskilles fra submucosa lag under et mikroskop, hvilket eliminerer behovet for farvning. Neuronale celletyper kan yderligere skelnes fra andre cellepopulationer med primære antistoffer, som udtrykkes af celletypen af interesse ^7. Derfor er denne procedure etablerer en lettere fremgangsmåde til berigelse af næsten rent neuronal cellepopulation, der kan anvendes til genekspression undersøgelser, immunhistokemi og andre morfologiske undersøgelser.

ve_content "> Denne undersøgelse har til formål at etablere en eksperimentel platform for at undersøge molekylære forandringer i olfaktoriske neuroner forbundet med sygdomstilstande og behandlingsrespons. For at løse dette, et lille sæt af røgfrie patienter, som opfyldte DSM-IV diagnostiske kriterier for BD baseret på Diagnostic interview til genetiske undersøgelser (DIG) ²² blev ansat til at gennemgå to nasale biopsier: en biopsi før behandling med lithium og den anden biopsi, efter 6 ugers daglig oral lithium terapi Endvidere skal de støtteberettigede BD patienterne være:. symptomatisk for depression baseret på at lave ≥10 ud af 60 i klinikeren administreret Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) ²³ symptomatisk for hypomani eller mani, baseret på en score ≥10 ud af 56 på klinikeren administreret Young-Mania Rating Scale (YMRS) ^24. eller ≥10 på begge MADRS og YMRS Rater-Inter-Rater koefficient på aftale mellem klinikere for begge skalaer er> 0,96 Efter biopsier, neuroner var Enri.tede fra OE ved LCM. Efter yderligere kontrolforanstaltninger kvalitet, for at sikre, udvinding af høj kvalitet RNA fra væv og neuronal berigelse, blev Real Time RT-PCR udført for at undersøge før og efter behandling ekspressionsniveauer af gener af interesse. De efterfølgende afsnit indeholder en beskrivelse af valideringen af ​​denne tilgang, fremhæver optimering af protokollen og de strategier, der blev ansøgt om fejlfinding protokollen.

Protocol

BEMÆRK: Alle forskningsaktiviteter frivillige i denne undersøgelse blev indgivet informeret samtykke dokumenter godkendt af Institutional Review Board af Howard University og Johns Hopkins University. Kun deltagere, der givet samtykke ved at underskrive informeret samtykke dokumenter blev indskrevet i undersøgelsen. Undersøgelsen base for denne analyse bestod af: 20 patienter (12 BD og 10 kontroller, 30% mænd) og gennemsnitsalder (SD) på 38,2 (14,1) år. BEMÆRK: Spray alle overflader med RNase Zap at fjern…

Representative Results

Protokollen og fejlfinding strategi i studiet af molekylære signaturer lykkedes optimeres. RNA kvalitet og neuronale berigelse kriterier for prøver, der skal bruges i længere nedstrøms Real Time-PCR-analyse blev standardiseret. RIN og RNA-koncentrationen blev undersøgt som forstyrrende faktorer til fundne ekspressionsniveauer. På baggrund af analysen af ​​flere prøver med Rins spænder 1-10, blev det bestemt, at et minimum RIN på ~ 3,0 og derover er tilstrækkelig for downstream analyse i denne undersøgelse…

Discussion

En ny platform for at opnå berigede olfaktoriske neuronale lag ved at kombinere nasal biopsi og LCM præsenteres og er blevet valideret i denne undersøgelse. Denne teknik kan have omfattende konsekvenser. Det kan anvendes mod biomarkør undersøgelser, også for behandlingsrespons og drug discovery indsats for andre neuropsykiatriske tilstande, hvilket gør en bredere indvirkning på området.

For at opnå høj kvalitet neuroner høj modtagelige for efterfølgende anvendelser, skal nogle f…

Materials

Reagent	Manufacturuer	Manufacturer Catalog #
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds	Sakura Finetek	4557
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D)	Carl Zeiss Microscopy	415190-9041-000
Rnase Zap	Ambion	AM9780
DEPC Treated Water	Quality Biological	351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System	Carl Zeiss Microscopy
Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No.5 Dumont Microdissction Forceps	Roboz	RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit	Ambion	AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix	Invitrogen	11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes	Applied Biosystems	Various
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016