Neurones olfactifs obtenus à l'aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux
Summary
Dans cette étude, une nouvelle plate-forme d'enquêter signatures moléculaires intraneuronaux de la réponse au traitement dans le trouble bipolaire (BD) a été développé et validé. Épithélium olfactif chez des patients BD a été obtenue par des biopsies nasales. Puis-microdissection laser a été combinée avec Temps réel RT-PCR pour enquêter sur la signature moléculaire de la réponse de lithium dans BD.
Abstract
Le trouble bipolaire (BD) est un trouble neuropsychiatrique sévère avec physiopathologie mal compris et généralement traité avec le stabilisateur de l'humeur, le carbonate de lithium. Les études animales ainsi que des études génétiques humaines indiquent que le lithium affecte cibles moléculaires qui sont impliqués dans la croissance neuronale, la survie et la maturation, et notamment les molécules impliquées dans la signalisation Wnt. Compte tenu de l'enjeu éthique à l'obtention de biopsies du cerveau pour étudier les changements moléculaires dynamiques associés avec le lithium-réponse dans le système nerveux central (SNC), on peut envisager l'utilisation de neurones obtenus à partir de tissus olfactifs pour atteindre cet goal.The épithélium olfactif contient des neurones récepteurs olfactifs à différents stades de développement et des cellules gliales comme des cellules de soutien. Cette offre une occasion unique d'étudier les changements dynamiques dans le SNC de patients atteints de maladies neuropsychiatriques, en utilisant le tissu olfactif obtenu en toute sécurité à partir de biopsies nasales. Pour pallier l'inconvénient posé par substcontamination antial de tissu olfactif biopsie avec des cellules non neuronales, une nouvelle approche pour obtenir des populations cellulaires enrichies neuronale a été développé en combinant biopsies nasales avec le laser capture microdissection. Dans cette étude, un système pour étudier les changements moléculaires dynamiques traitement associé dans le tissu neuronal a été élaboré et validé, en utilisant un petit échantillon pilote de patients BD recrutés pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réponse au traitement au lithium.
Introduction
Le trouble bipolaire (BD) est un trouble neuropsychiatrique sévère, caractérisée par des changements pathologiques de l'humeur, le dynamisme et la cognition 1. Lithium utilisé pour le traitement de BD a été montré pour modifier les niveaux d'ARNm de l'état d'équilibre d'un grand nombre de gènes dans les études animales 2, mais il reste inconnu si l'un de ces molécules est associée à la réponse clinique chez l'homme 2. Comprendre le mécanisme de la réponse au lithium faudrait étudier les changements moléculaires induite lithium dans les tissus neuronaux. Malheureusement, il ne est pas pratique d'obtenir des biopsies du cerveau de patients BD pré et post-traitement lithium pour identifier les signatures moléculaires de la réponse au lithium. Les tissus du cerveau post-mortem ont été utilisés pour étudier des biomarqueurs en BD, cependant, ils ne peuvent pas être utilisés pour évaluer les marqueurs moléculaires associés à des changements dynamiques dans les émotions, la cognition et de conduire; et la validité de la réponse au traitement a posteriori déterminé de lithium peut être problématique 4. Lymphocytes et les autres cellules sanguines pourraient être utiles, mais les changements moléculaires dans les cellules de sang peuvent ne pas refléter les modifications neuronales 3-5. Liquide céphalo-rachidien peut être insuffisant pour obtenir des informations sur les molécules intracellulaires qui peuvent refléter des changements intrinsèques associées à la maladie et des médicaments réversible.
L'épithélium olfactif (OE) est un élément unique du système nerveux central (SNC), embryologiquement liés aux structures limbiques 6; et il est facilement accessible par biopsies nasales. Il est constitué de cellules gliales cellules comme des cellules de soutien (par exemple, sustentaculaires), basales proliférantes, et les neurones récepteurs olfactifs à différents stades de développement 9.7. Par conséquent, OE offre une occasion unique d'étudier de manière accessible changements dynamiques dans le SNC de patients atteints de maladies neuropsychiatriques 7. Des études démontrent l'utilité de l'OE comme un tissu de substitution pour l'étude des maladies associées événements qui reflètent ces occurring dans les neurones du cerveau 8,9. Par exemple, des études ont utilisé OE pour enquêter sur les profils moléculaires associés à des troubles psychiatriques 10-14. Système olfactif sert également à identifier endophenoytpes cliniques tels que des déficits olfactifs qui sont associés à des symptômes négatifs de la schizophrénie 15. En outre, les processus neurodéveloppementaux continuent dans le OE long de la vie, en fournissant un moyen utile pour modéliser la physiopathologie sous-jacente des conditions psychiatriques 8,9.
Cependant, un inconvénient de l'utilisation de ce tissu est la contamination importante des biopsies olfactifs avec des cellules non neuronales 16. Par exemple, l'ARN total utilisé pour les études d'expression génique dans des études précédentes OE contenait l'ARN extrait à partir de l'ensemble du tissu nasal biopsie comprenant l'ARN à partir de cellules non neuronales 17. Par conséquent, les approches précédentes ont été limitées par la qualité des cellules. Pour surmonter ce problème, une nouvelle approche pour obtenir populations de cellules neuronales enrichies en combinant biopsies nasales avec laser capture microdissection (LCM) a été élaboré 18.
LCM est une technique qui permet l'isolement sélectif des cellules en utilisant le découpage au laser UV combinée à infra-rouge de 19 à 21 laser. Combinant LCM à l'approche OE minimiser la contamination importante de OE par les cellules non-neuronales, améliorant ainsi l'enrichissement des cellules neuronales 18. En outre, la couche neuronale peut être distinguée de la couche de sous-muqueuse au microscope, ce qui élimine la nécessité d'une coloration. Types de cellules neuronales peuvent en outre être distinguées des autres populations de cellules en utilisant des anticorps primaires qui sont exprimés par le type d'intérêt 7 de la cellule. Par conséquent, cette procédure établit une méthode plus simple pour l'enrichissement de la population de cellules presque purement neuronale qui peut être utilisé pour des études d'expression génique, immunohistochimie et autres investigations morphologiques.
ve_content "> Cette étude vise à établir une plate-forme expérimentale pour étudier les changements moléculaires dans les neurones olfactifs associés à des états pathologiques et la réponse au traitement. Pour y remédier, un petit groupe de patients non-fumeurs qui ont rencontré les critères diagnostiques du DSM-IV pour BD basée sur l'interview diagnostique pour les études génétiques (DIG) 22 a été recruté pour subir deux biopsies nasales: une biopsie pré-traitement avec le lithium et le deuxième biopsie, après 6 semaines de traitement quotidien de lithium orale outre, les patients BD éligibles doivent être:. symptomatique de la dépression , sur la base marquant ≥10 sur 60 dans le clinicien administré Montgomery Asberg-Rating Scale (MADRS) 23; symptomatique pour hypomanie ou de manie, basé sur un score ≥10 sur 56 sur le clinicien administré Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. ≥10 ou sur les deux MADRS et YMRS coefficient évaluateur-Inter-évaluateur d'accord entre les cliniciens pour les deux échelles est> 0,96 Après biopsies, les neurones étaient enri.ched d'OE par LCM. Suite à des mesures supplémentaires de contrôle de la qualité, afin d'assurer l'extraction de l'ARN de haute qualité du tissu neuronal et l'enrichissement, en temps réel RT-PCR a été menée pour étudier les niveaux pré- et post-expression de traitement de gènes d'intérêt. Les sections suivantes contiennent une description de la validation de cette approche, soulignant l'optimisation du protocole et les stratégies qui ont été appliquées pour le dépannage du protocole.Protocol
Representative Results
Discussion
Une nouvelle plate-forme pour obtenir des couches de neurones olfactifs enrichis en combinant la biopsie nasale et LCM est présenté et a été validé dans cette étude. Cette technique peut avoir de vastes répercussions. Il peut être appliqué vers des études de biomarqueurs, y compris ceux pour la réponse au traitement, et les efforts de découverte de médicaments pour d'autres affections neuropsychiatriques, avoir un impact plus large dans le domaine.
Pour obtenir neurones de h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
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