Las neuronas olfativas obtenidos por medio de biopsia nasal combinado con microdisección por láser captura: un enfoque potencial para el Estudio de la respuesta al tratamiento en los trastornos mentales
Summary
En este estudio, una novedosa plataforma para investigar firmas moleculares intraneuronales de la respuesta al tratamiento en el trastorno bipolar (TB) fue desarrollado y validado. Epitelio olfativo de pacientes con TB se obtuvo a través de biopsias nasales. Entonces láser captura microdissection se combinó con Real Time RT PCR para investigar la firma molecular de la respuesta de litio en BD.
Abstract
El trastorno bipolar (BD) es un trastorno neuropsiquiátrico grave con fisiopatología mal entendida y típicamente tratado con el estabilizador del humor, carbonato de litio. Los estudios en animales así como estudios genéticos humanos indican que el litio afecta a dianas moleculares que están implicados en el crecimiento neuronal, la supervivencia y maduración, y en particular las moléculas que participan en la señalización de Wnt. Dado el desafío ético para la obtención de biopsias cerebrales para la investigación de cambios moleculares dinámicas asociadas con litio-respuesta en el sistema nervioso central (CNS), se puede considerar el uso de las neuronas olfativas obtenidas de tejidos para lograr este goal.The epitelio olfativo contiene neuronas receptoras olfativas en diferentes etapas de desarrollo y glial-como células de soporte. Esto proporciona una oportunidad única para estudiar los cambios dinámicos en el sistema nervioso central de los pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas, utilizando tejido olfativo obtenido con seguridad a partir de biopsias nasales. Para superar el inconveniente planteado por substcontaminación antial de tejido olfativo biopsia con las células no neuronales, un enfoque novedoso para obtener poblaciones celulares enriquecidas neuronal fue desarrollado mediante la combinación de biopsias nasales con láser de microdisección de captura. En este estudio, un sistema para la investigación de tratamiento asociada a los cambios moleculares dinámicas en el tejido neuronal fue desarrollado y validado, utilizando una pequeña muestra piloto de pacientes BD reclutados para el estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta al tratamiento de litio.
Introduction
El trastorno bipolar (BD) es un trastorno neuropsiquiátrico grave, caracterizada por cambios patológicos en el estado de ánimo, la unidad 1 y la cognición. El litio se utiliza para el tratamiento de BD se ha demostrado que altera los niveles de estado estacionario de ARNm de un gran número de genes en estudios con animales 2, pero se desconoce si alguna de estas moléculas se asocia con la respuesta clínica en los seres humanos 2. Entender el mecanismo de respuesta de litio requeriría investigar cambios moleculares inducida por litio en los tejidos neuronales. Desafortunadamente, no es práctico para obtener biopsias cerebrales de los pacientes BD pre y post-tratamiento de litio para identificar firmas moleculares de respuesta de litio. Los tejidos del cerebro post mortem se han utilizado para estudiar biomarcadores en BD, sin embargo, no pueden ser utilizados para evaluar marcadores moleculares asociados con cambios dinámicos en las emociones, la cognición y la unidad; y la validez de la respuesta al tratamiento de litio retrospectivamente comprobada puede ser problemático 4. Los linfocitos y otras células sanguíneas podrían ser útiles, pero los cambios moleculares en las células sanguíneas pueden no reflejar alteraciones neuronales 3-5. El líquido cefalorraquídeo puede ser insuficiente para obtener información sobre las moléculas intracelulares que pueden reflejar cambios intrínsecos asociados a la enfermedad y la medicación reversible.
El epitelio olfatorio (OE) es una parte única del sistema nervioso central (SNC), relacionado embrionarias a las estructuras límbicas 6; y es fácilmente accesible a través de biopsias nasales. Consiste en la glía como células de soporte células (es decir, sustentaculares), basales proliferantes, y las neuronas olfativas del receptor en diferentes etapas de desarrollo 7.9. Por lo tanto, la OE ofrece una oportunidad única para estudiar accesible cambios dinámicos en el sistema nervioso central de los pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas 7. Los estudios están demostrando la utilidad de la OE como un tejido sustituto para la investigación de los casos de enfermedad asociada que reflejan esos occurring en las neuronas cerebrales 8,9. Por ejemplo, los estudios han utilizado OE para investigar los perfiles moleculares asociados con trastornos psiquiátricos 10-14. Sistema olfativo también sirve para identificar endophenoytpes clínicos tales como déficits olor que están asociados con síntomas negativos de la esquizofrenia 15. Además, los procesos de desarrollo neurológico continúan en el entorno operativo durante toda la vida, proporcionando una vía útil para modelar la fisiopatología subyacente de condiciones psiquiátricas 8,9.
Sin embargo, un inconveniente del uso de este tejido es la contaminación sustancial de biopsias olfativas con células no neuronales 16. Por ejemplo, el ARN total se utiliza para estudios de expresión génica en estudios previos OE contenía ARN extraído de la totalidad de la biopsia de tejido nasal incluyendo ARN de las células no neuronales 17. Por lo tanto, los enfoques anteriores se han limitado por la calidad de las células. Para superar este problema, un enfoque novedoso para obtener poblaciones de células neuronales enriquecidos mediante la combinación de las biopsias nasales con láser captura microdissection (LCM) se ha desarrollado 18.
LCM es una técnica que permite el aislamiento selectivo de células por medio de corte por láser UV en combinación con láser de infrarrojos 19-21. La combinación de LCM con el enfoque OE minimiza la contaminación sustancial de OE por las células no neuronales, mejorando así el enriquecimiento de las células neuronales 18. Además, la capa neuronal se puede distinguir de la capa submucosa bajo un microscopio, eliminando así la necesidad de tinción. Tipos de células neuronales además se pueden distinguir de otras poblaciones de células utilizando anticuerpos primarios que se expresan por el tipo de célula de interés 7. Por lo tanto, este procedimiento establece un método más fácil para el enriquecimiento de la población de células casi puramente neuronal que se puede utilizar para estudios de expresión génica, inmunohistoquímica y otras investigaciones morfológicas.
ve_content "> Este estudio tiene como objetivo establecer una plataforma experimental para investigar los cambios moleculares en las neuronas olfativas asociadas con estados de enfermedad y la respuesta al tratamiento. Para hacer frente a esto, un pequeño grupo de pacientes no fumadores que cumplían los criterios diagnósticos del DSM-IV para el BD basa en la Entrevista Diagnóstica para Estudios Genéticos (DIG) 22 fue reclutado para someterse a dos biopsias nasales: una biopsia pre-tratamiento con litio y la segunda biopsia, tras 6 semanas de tratamiento con litio oral diaria Además, los pacientes BD elegibles deben ser:. sintomático para la depresión , basado en anotar ≥10 de 60 en el clínico administrado Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomático de hipomanía o manía, basado en una puntuación ≥10 de 56 en el clínico administrado Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. o ≥10 en ambos MADRS y YMRS coeficiente Evaluador-inter-evaluador de acuerdo entre los clínicos para ambas escalas es> 0,96 Después de biopsias, las neuronas eran enri.ched de OE por LCM. Tras las medidas adicionales de control de calidad, para garantizar la extracción de ARN de alta calidad de los tejidos y el enriquecimiento neuronal, en tiempo real RT PCR se llevó a cabo para investigar los niveles de pre y post-tratamiento de expresión de genes de interés. Las secciones siguientes contienen una descripción de la validación de este enfoque, destacando la optimización del protocolo y las estrategias que se aplicaron para solución de problemas del protocolo.Protocol
Representative Results
Discussion
Una nueva plataforma para la obtención de capas neuronales olfatorios enriquecidos mediante la combinación de la biopsia nasal y LCM se presenta y se ha validado en este estudio. Esta técnica puede tener amplias implicaciones. Puede ser aplicado a los estudios de biomarcadores, incluyendo los de la respuesta al tratamiento, y los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para otras condiciones neuropsiquiátricas, haciendo un impacto más amplio en el campo.
Para obtener neuronas de alta c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
References
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