Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais
Summary
Neste estudo, um romance plataforma para investigar assinaturas moleculares intraneuronal de resposta ao tratamento do transtorno bipolar (TB) foi desenvolvido e validado. O epitélio olfatório de pacientes com TB foi obtido através de biópsias nasais. Em seguida, captura a laser microdissection foi combinado com Tempo real RT PCR para investigar a assinatura molecular de resposta de lítio em BD.
Abstract
O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave com fisiopatologia mal compreendido e, normalmente tratados com o estabilizador de humor, carbonato de lítio. Os estudos em animais, bem como estudos genéticos humanos indicam que o lítio afecta alvos moleculares que estão envolvidas no crescimento neuronal, a sobrevivência e a maturação, e nomeadamente as moléculas envolvidas na sinalização de Wnt. Dado o desafio ético para a obtenção de biópsias cerebrais para investigar as alterações moleculares associadas a dinâmicas de lítio-resposta no sistema nervoso central (SNC), pode-se considerar o uso de neurônios obtidos a partir de tecidos olfativos para alcançar este goal.The epitélio olfatório contém neurônios receptores olfativos em diferentes fases de desenvolvimento e glia do tipo células de suporte. Isso proporciona uma oportunidade única para estudar as alterações dinâmicas do CNS de pacientes com doenças neuropsiquiátricas, usando tecido olfativo obtido com segurança a partir de biópsias nasais. Para superar o problema colocado por substantial contaminação de tecido biopsiado olfactivo com células não neuronais, uma nova abordagem para a obtenção de populações de células neuronais enriquecido foi desenvolvido através da combinação de biópsias nasais com captura por laser microdissecação. Neste estudo, um sistema para investigar as alterações moleculares dinâmicas associadas ao tratamento no tecido neuronal foi desenvolvido e validado, utilizando uma pequena amostra piloto de pacientes com TB recrutados para o estudo dos mecanismos moleculares de resposta ao tratamento de lítio.
Introduction
O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave, caracterizada por alterações patológicas do humor, conduzir e cognição 1. Lítio utilizada para o tratamento de BD tem sido mostrado para alterar os níveis de mRNA de estado estacionário de um grande número de genes em estudos com animais 2, mas continua a ser desconhecida, se qualquer destas moléculas está associada com a resposta clínica em seres humanos 2. Compreender o mecanismo de resposta de lítio exigiria investigar alterações moleculares induzidas por lítio em tecidos neuronais. Infelizmente, não é prático para a obtenção de biópsias do cérebro de pacientes com TB pré e pós-terapia de lítio para identificar assinaturas moleculares de resposta de lítio. Tecidos cerebrais pós-morte foram usados para estudar biomarcadores em BD, no entanto, eles não podem ser usados para avaliar marcadores moleculares associados com mudanças dinâmicas na emoções, cognição e dirigir; e a validade do retrospectivamente apurado resposta ao tratamento de lítio pode ser problemático 4. Os linfócitos e outras células do sangue pode ser útil, mas as mudanças moleculares nas células do sangue podem não refletir alterações neuronal 3-5. O líquido cefalorraquidiano pode ser insuficiente para obter informações sobre as moléculas intracelulares que podem refletir mudanças intrínsecas associados à doença e medicação reversível.
O epitélio olfatório (OE) é uma parte única do sistema nervoso central (SNC), relacionada com a embryologically de estruturas límbicas 6; e é facilmente acessível através de biópsias nasais. É constituída por glial-células como células de suporte (ou seja, sustentaculares), basais em proliferação e neurónios dos receptores olfactivos em diferentes fases de desenvolvimento 7-9. Portanto, OE oferece uma oportunidade única para estudar acessível mudanças dinâmicas no SNC de pacientes com doenças neuropsiquiátricas 7. Estudos demonstram a utilidade do OE como um substituto do tecido para investigar acontecimentos de doença associados que reflectem aquelas occurring nos neurônios do cérebro 8,9. Por exemplo, estudos têm utilizado OE para investigar os perfis moleculares associados com condições psiquiátricas 10-14. Olfactiva sistema também serve para identificar endophenoytpes clínicos, tais como défices cheiro que estão associados com sintomas negativos da esquizofrenia 15. Além disso, os processos de desenvolvimento neurológico continuar no OE ao longo da vida, fornecendo um caminho útil para modelar a fisiopatologia subjacente de condições psiquiátricas 8,9.
No entanto, uma desvantagem da utilização deste tecido é a contaminação substancial de biópsias olfactivos com células não-neuronais 16. Por exemplo, o RNA total usado para estudos de expressão de genes em estudos anteriores OE continha RNA extraído de todo o tecido biopsiado nasal incluindo ARN a partir de células não-neuronais 17. Portanto, abordagens anteriores têm sido limitados pela qualidade das células. Para superar esse problema, uma nova abordagem para obter populações de células neuronais enriquecido por combinando biópsias nasais com captura a laser microdissection (LCM) foi desenvolvido 18.
LCM é uma técnica que permite o isolamento selectivo de células usando corte por laser combinado com UV de infra-vermelho do laser 19-21. Combinando LCM com OE abordagem minimiza a contaminação substancial de OE por células não-neuronais, aumentando assim o enriquecimento de células neuronais 18. Além disso, a camada neuronal pode ser distinguida a partir da submucosa, sob um microscópio, eliminando assim a necessidade de coloração. Tipos de células neuronais pode ainda ser distinguida de outras populações de células, utilizando anticorpos primários que são expressas pelo tipo celular de interesse 7. Por conseguinte, este procedimento estabelece um método mais fácil para o enriquecimento da população de células quase puramente neuronal que pode ser utilizada para estudos de expressão de genes, imuno-histoquímica e outras investigações morfológicas.
ve_content "> Este estudo visa estabelecer uma plataforma experimental para investigar as alterações moleculares em neurônios olfativos associadas a estados de doença e resposta ao tratamento. Para resolver isso, um pequeno grupo de pacientes não-fumantes, que preencheram os critérios diagnósticos do DSM-IV para BD baseado em Entrevista Diagnóstica para Estudos Genéticos (DIG) 22 foi recrutado para passar por duas biópsias nasais: uma biópsia pré-tratamento com lítio e a segunda biópsia, após 6 semanas de tratamento com lítio oral diária Além disso, os pacientes com TB elegíveis devem ser:. sintomático para a depressão , com base na pontuação ≥10 de 60 em o clínico administrado Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomática de hipomania ou mania, baseado em uma pontuação ≥10 de 56 sobre o clínico administrado Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. ≥10 ou em ambos MADRS e YMRS coeficiente Rater-Inter-Rater de acordo entre os clínicos para ambas as escalas é> 0,96 Depois de biópsias, os neurônios foram enri.ched do OE por LCM. Na sequência das medidas adicionais de controle de qualidade, para garantir a extração de RNA de alta qualidade a partir do tecido e enriquecimento neuronal, Tempo real RT PCR foi realizado para investigar os níveis pré e pós-tratamento de expressão de genes de interesse. As seções seguintes, conter uma descrição da validação desta abordagem, com destaque para a otimização do protocolo e as estratégias que foram aplicadas para o protocolo de resolução de problemas.Protocol
Representative Results
Discussion
Uma nova plataforma para a obtenção de camadas de neurônios olfativos enriquecidos pela combinação de biópsia nasal e LCM é apresentado e foi validado neste estudo. Esta técnica pode ter grandes implicações. Ele pode ser aplicado para os estudos de biomarcadores, incluindo aqueles para a resposta ao tratamento, e os esforços de descoberta de medicamentos para outras doenças neuropsiquiátricas, fazendo um impacto mais amplo no campo.
Para obter neurônios de alta qualidade passí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
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