Lukt Nervceller erhållits genom Nasal Biopsi Kombinerad med Laser-Capture Microdissection: En Potentiell Approach att studera behandlingssvar hos psykiska störningar

Summary

I denna studie, en ny plattform utreda intraneuronala molekylära signaturer behandlingssvar vid bipolär sjukdom (BD) har utvecklats och validerats. Luktepitel från BD patienter erhölls genom nasala biopsier. Sedan laser-capture microdissection kombinerades med realtid RT-PCR för att undersöka den molekylära tecknandet av litium svar i BD.

Abstract

Bipolär sjukdom (BD) är en allvarlig neuropsykiatrisk sjukdom med dåligt förstått patofysiologi och typiskt behandlas med stämningsstabiliserande, litiumkarbonat. Djurstudier samt genetiska studier visar att litium påverkar molekylära mål som är involverade i neuronal tillväxt, överlevnad och mognad, och särskilt molekyler som är involverade i Wnt signalering. Med tanke på den etiska utmaningen att få hjärn biopsier för att undersöka dynamiska molekylära förändringar i samband med litium-respons i det centrala nervsystemet (CNS), kan man överväga att använda nervceller som erhållits från doft vävnader för att uppnå detta goal.The luktepitel innehåller luktreceptor nervceller i olika stadier av utveckling och gliaceller liknande stödjande celler. Detta ger en unik möjlighet att studera dynamiska förändringar i CNS hos patienter med neuropsykiatriska sjukdomar, med hjälp av lukt vävnad säkert erhållas från nasala biopsier. För att övervinna nackdelen utgörs av substantial kontamination av biopsier lukt vävnad med icke-neuronala celler, var en ny metod för att erhålla anrikade neuronala cellpopulationer som utvecklats genom att kombinera nasala biopsier med laser capture mikrodissektion. I denna studie var ett system för att utreda behandlingsassocierade dynamiska molekylära förändringar i nervvävnad utvecklats och validerats, med hjälp av en liten pilotprov BD patienter rekryteras för att studera de molekylära mekanismerna för litium behandlingssvar.

Introduction

Bipolär sjukdom (BD) är en allvarlig neuropsykiatrisk störning, som kännetecknas av sjukliga förändringar i humör, kör och kognition ^1. Litium används för behandling av BD har visats påverka steady state mRNA nivåer av ett stort antal gener i djurstudier ^2, men det är fortfarande okänt om någon av dessa molekyler är förknippad med kliniskt svar hos människor ^2. Förstå mekanismen av litium svar skulle kräva utreda litium-inducerad molekylära förändringar i neuronala vävnader. Tyvärr är det inte praktiskt att få hjärn biopsier av BD patienter före och efter litiumbehandling för att identifiera molekylära signaturer av litium svar. Postmortala hjärnvävnader har använts för att studera biomarkörer i BD, men de kan inte användas för att bedöma molekylära markörer associerade med dynamiska förändringar i känslor, kognition och kör; och giltigheten av efterhand konstaterat litium behandlingssvar kan vara problematiskt ⁴. Lymfocyter och andra blodkroppar kan vara användbar, men molekylära förändringar i blodceller kanske därför inte speglar neuronala förändringar ^3-5. Cerebrospinalvätska kan vara otillräckligt för att få information om intracellulära molekyler som kan reflektera sjukdomsassocierade och medicinering-reversibel inneboende förändringar.

Den luktepitel (OE) är en unik del av det centrala nervsystemet (CNS), embryologiskt relaterade till limbiska strukturer ^6; och det är lätt att nå via nasala biopsier. Den består av gliaceller liknande stöd (dvs sustentacular) celler, basala prolifererande celler och luktreceptor nervceller i olika stadier av utveckling ^7-9. Därför ger OE en unik möjlighet att accessibly studera dynamiska förändringar i CNS hos patienter med neuropsykiatriska sjukdomar ^7. Studier visar nyttan av OE som surrogat vävnad för undersökning av sjukdomar förknippade händelser som speglar dessa occurring i hjärnans nervceller ^8,9. Till exempel har studier utnyttjas OE för att undersöka molekylära profiler associerade med psykiatriska tillstånd ^10-14. Luktsinnet tjänar också till att identifiera kliniska endophenoytpes såsom lukt underskott som är förknippade med negativa symptom på schizofreni ^15. Dessutom nervsystemets processer fortsätta i OE hela livet, vilket ger en användbar väg för att modellera det underliggande patofysiologin för psykiatriska tillstånd ^8,9.

Emellertid är en nackdel med användningen av denna vävnad är den betydande kontaminering av lukt biopsier med icke-neuronala celler ^16. Till exempel, total-RNA används för genuttryck studier i tidigare OE studier innehöll RNA extraherat från hela nasala biopsier vävnad inklusive RNA från icke-neuronala celler ^17. Därför har tidigare tillvägagångssätt varit begränsad av kvaliteten på celler. För att lösa detta problem, att en ny metod få anrikade neuronala cellpopulationer genom att kombinera nasala biopsier med laser-capture microdissection (LCM) har utvecklats ^18.

LCM är en teknik som gör det möjligt för selektiv isolering av celler genom att använda UV laserskärning i kombination med infraröd laser ^19-21. Kombinera LCM med OE tillvägagångssätt minimerar betydande förorening av OE av icke-neuronala celler, och därigenom öka anrikning av neuronala celler ^18. Dessutom kan den neuronala skiktet särskiljas från submucosa skiktet under ett mikroskop, vilket därigenom eliminerar behovet av färgning. Neuronala celltyper kan vidare skiljas från andra cellpopulationer med användning av primära antikroppar som uttrycks av celltypen av intresse ^7. Därför denna procedur upprättar en enklare metod för anrikning av nästan rent neuronala cellpopulation som kan användas för genuttryck studier, immunohistokemi och andra morfologiska undersökningar.

ve_content "> Denna studie syftar till att etablera en experimentplattform för att undersöka molekylära förändringar i lukt nervceller i samband med sjukdomstillstånd och behandlingssvar. För att åtgärda detta, en liten uppsättning rökfria patienter som uppfyllde DSM-IV diagnostiska kriterier för BD baserat på Diagnostik intervju för genetiska studier (DIG) ²² rekryterades genomgå två nasala biopsier: en biopsi förbehandling med litium och andra biopsi, efter 6 veckors daglig oral litiumterapi Dessutom måste berättigade BD patienter vara. symptomatisk för depression , baserat på scoring ≥10 av 60 i klinikern administrerade Montgomery-Åsberg Rating Scale (MADRS) ^23; symptomatisk för hypomani eller mani, baseras på en värdering ≥10 av 56 om läkaren administrerade Young-Mania Rating Scale (YMRS) ^24,. eller ≥10 på båda MADRS och YMRS Rater-Inter-Rater koefficient överenskommelse mellan kliniker för båda skalorna är> 0,96 Efter biopsier, nervceller var Enri.rikas från OE av LCM. Efter ytterligare åtgärder för kvalitetskontroll, för att säkerställa utvinning av hög kvalitet RNA från vävnaden och neuronal anrikning, blev Real Time RT-PCR för att undersöka för- och efterbehandling expressionsnivåer av gener av intresse. De därpå följande avsnitten innehåller en beskrivning av validering av detta tillvägagångssätt, med fokus på optimering av protokollet och de strategier som tillämpades för felsökning protokollet.

Protocol

OBS: All forskning volontärer i denna studie administrerades informerade samtycke ska godkänts av Institutional Review Board of Howard University och Johns Hopkins University. Endast deltagare som samtyckt genom att underteckna informerat samtycke dokument inkluderades i studien. Studien bas för denna analys bestod av: 20 personer (12 BD och 10 kontroller, 30% män) och medelålder (sd) på 38,2 (14,1) år. OBS: Spraya alla ytor med RNas Zap att avlägsna RNas föroreningar från glas- och plastytor. <p cl…

Representative Results

Protokollet och felsökningsstrategi i studiet av molekylära signaturer framgångsrikt optimeras. RNA kvalitet och neuronala kriterier anriknings för prover som ska användas i längre nedströms realtid-PCR-analys var standardiserade. RIN och RNA-koncentrationen undersöktes som confoundingfaktorer till upptäckta uttrycksnivåer. Baserat på en analys av flera prover med Rins sträcker 1-10, bestämdes det att en minimi RIN på ~ 3.0 och uppåt är tillräcklig för nedströms analys i denna studie. Som ett resultat…

Discussion

En ny plattform för att erhålla anrikade lukt neuronala lager genom att kombinera nasal biopsi och LCM presenteras och har validerats i denna studie. Denna teknik kan ha omfattande konsekvenser. Den kan tillämpas mot biomarkörer studier, även sådana för behandlingssvar, och läkemedelsforskning insatser för andra neuropsykiatriska tillstånd, vilket gör en bredare genomslag i fält.

För att få hög kvalitet nervceller mottagliga för tillämpningar efter, måste några kritiska oc…

Materials

Reagent	Manufacturuer	Manufacturer Catalog #
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds	Sakura Finetek	4557
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D)	Carl Zeiss Microscopy	415190-9041-000
Rnase Zap	Ambion	AM9780
DEPC Treated Water	Quality Biological	351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System	Carl Zeiss Microscopy
Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No.5 Dumont Microdissction Forceps	Roboz	RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit	Ambion	AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix	Invitrogen	11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes	Applied Biosystems	Various
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016