Generation af transgene<em> Hydra</em> Af Embryo Mikroinjektion

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

Hydra er blevet brugt til at studere regeneration, mønsterdannelse og stamceller til cirka 250 år ² Hydra har en enkel kropsplan bestående af tre cellelinier:. Ektodermal epitel, endoderm epitel og interstitiel. Det rørformede legeme er dannet af ektodermal og endodermale epiteliale cellelinier, som hver er et enkelt cellelag. Alle de epiteliale celler i kroppen kolonnen er mitotisk. Når epitelceller forskydes i ekstremiteterne ^3, hovedet (mund og fangarme) ved den mundtlige ende eller foden (basal disk) i aboral ende, de arrestere i G2-fasen af cellens cyklus og ændre celle skæbne ^4. Cellerne i det interstitielle afstamning opholde sig mellemrummene mellem epitelceller. Denne slægt understøttes af multipotente stamceller, der er placeret i det ektodermale epitel lag af kroppen kolonne ^5. De interstitielle stamceller giver anledning til tre somatiske cell typer (nerver, kirtel celler og nematocytes) og kønsceller ^6,7.

Som medlem af phylum Cnidaria, søster gruppe til alle bilaterians kan Hydra kaste lys over de grundlæggende biologiske processer deles blandt flercellede dyr. Indtil for nylig blev disse bestræbelser hæmmes af manglen på pålidelige metoder til forstyrrelse af genfunktion. Men med udviklingen af transgene metode ^1, er vi nu i stand til at drage fuld fordel af Hydra at få en bedre forståelse af de grundlæggende mekanismer er fælles for flercellede dyr, såsom stamceller funktion, regenerering og mønster. Transgene Hydra linjer er etableret ved injektion af plasmid DNA i embryoer, hvilket resulterer i tilfældig integration og kimære ekspression i en betydelig hyppighed af larver. En linje med ensartet udtryk i en bestemt slægt kan etableres ved ukønnet formering. Evnen til klonalt forplante transgENIC Hydra linjer er en fordel i forhold til flertallet af dyremodeller, som kan formeres kun ved seksuel reproduktion. Endvidere kan transgene celler spores let in vivo på grund af gennemsigtigheden af dyret og fraværet af endogene fluorescerende proteiner ^8.

I de syv år, siden den første transgene Hydra linjer blev foretaget ^1, sådanne linjer er blevet brugt til en lang række applikationer. Ekspression af fluorescerende proteiner i forskellige celletyper har gjort det muligt at spore celle bevægelse, observere ændringer i celleform og spore celleskæbner både vildtype betingelser og efter kemisk forstyrrelse ^1,5,9-12. Desuden ekspressionen af ​​forskellige fluorescerende proteiner i de forskellige afstamninger muliggør FACS isolering af specifikke cellepopulationer. Denne teknik er blevet anvendt til sekventering af stamceller specifikke mRNA og slægt-specifikke små RNA ^13,14. Mens promotorenen af de to Hydra aktin gener har været mest udbredt, et par celletype-specifikke promotorer er blevet identificeret og anvendt til at drive ekspression af GFP i transgen Hydra ^9,11,15,16. I fremtiden vil celletype-specifikke promotorer tillader observation og indsamling af en specifik celletype. Desuden blev en transgen tilgang med held anvendt til at definere de cis-virkende regulatoriske elementer af det Wnt3 promotoren ^17.

Udviklingen af transgene metoder Hydra giver en robust metode til at teste funktionen af gener ved ektopisk ekspression, overekspression og knockdown. Transgene dyr er blevet gjort, som udtrykker fluorescens-mærkede proteiner for at undersøge både funktion og cellulær lokalisering ^18-20. Hertil kommer, at ekspressionen af RNA-hårnåle i 3'UTR af GFP transgen fører til knockdown af målgener ^21,22. I disse fremgangsmåder er påkrævet GFP at identificereog spore transgene væv under oprettelsen af ​​den transgene linje. Det er imidlertid sandsynligt, at GFP-molekylet i nogle tilfælde ville interferere med funktionen af ​​det mærkede protein. En nylig undersøgelse viser, at Hydra gener kan være anbragt i en operon-konfiguration, dvs er polycistroniske transkripter fremstillet, som derefter separeres ved trans-splejset leder tilsætning og oversat separat ^23. Ved at placere et gen, der koder et protein eller et RNA hårnål i opstrøms position en operon og en fluorescerende protein-gen i den nedstrøms position, kan man spore transgene væv uden at mærke det gen der koder for proteinet eller RNA hårnål. Denne metode er blevet anvendt til at udtrykke en RNA hårnål i en operon konfiguration med DsRed2 for at opnå genet Knockdown ^14.

Protocol

1. Fremstilling af plasmid-DNA, nåle og Injection Dishes Forbered plasmid-DNA ved hjælp af et High Speed ​​Maxi eller Midi kit og koncentrere DNA'et til 2,5 mg / ml ved anvendelse af ethanol udfældning. DNA-pelleten bør opløses i nuklease-frit deioniseret vand. Opbevar DNA i 10 til 20 ul alikvoter ved -20 ° C. (Se Supplerende Tabel 1 for en liste over tilgængelige vektorer) Lav en indsprøjtning skålen ved at bruge agarose at konstruere et trug til at holde embryoer …

Representative Results

Etablering transgene Hydra linjer Feed transgene larver hver 2-3 dage med artemia. Larver nogle gange ikke spise for en dag eller to efter klækning. Nogle nye larver vil aldrig spiser, og derfor vil ikke overleve. Hvis nyudklækkede unge er transgene i enten ektodermal (figur 1A) eller endodermal epitelvæv, så dyret til at spire og indsamle de knopper, der har den mest transgene væv (figur 1B, C). Fortsæt med at gøre dette med de nye kno…

Discussion

Hydra rutinemæssigt gengiver ukønnet, men kræver miljømæssige stimuli at begynde at producere kønsceller. Disse stimuli ikke veldefineret for de fleste Hydra arter og kan afvige fra stamme til stamme. En væsentlig hindring for produktionen af transgene Hydra er at opnå embryoner på en regelmæssig basis, fordi det kan være svært i et laboratorium indstilling til at fremkalde Hydra at blive seksuelt. AEP-stamme ^25, producerer imidlertid mælke let i laboratoriet, …

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151