Transgenik Üretimi<em> Hydra</em>: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo
Summary
Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.
Abstract
As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.
Introduction
Hydra rejenerasyon, desen oluşumunu incelemek ve yaklaşık 250 yıl 2 kök hücre için kullanılır olmuştur Hydra üç hücre soylarının oluşan basit vücut planı vardır:. Ektodermal epitel, endodermal epitel ve interstisyum. Boru şeklindeki gövde, tek bir hücre tabakası, her biri ve ektodermal endodermal epitel soylar tarafından oluşturulur. Vücut sütunundaki epitel hücrelerinin mitotik tüm bulunmaktadır. Epitel hücreleri ekstremitelerde 3 yerdeğiştiren zaman, aboral sonunda ağız ucuna veya ayak (bazal disk) de baş (ağız ve dokunaçlarının), bunlar, hücre döngüsünün G2 fazında hücre kaderine 4 değiştirin. Interstisyel soyunun hücreleri, epitel hücreleri arasındaki boşlukları içinde bulunur. Bu soy vücut sütun 5 ektodermal epitel tabakasında bulunan multipotent kök hücreler tarafından desteklenmektedir. Interstisyel kök hücreler üç somatik cel doğuranl türleri (sinirler, bezi hücreleri ve nematocytes) ve germ hücreleri 6,7.
Filumuna Sölenteralar bir üyesi olarak, tüm bilaterians için kardeş grup, Hydra çok hücreli hayvanlar arasında paylaşılan temel biyolojik süreçlere ışık tutabilir. Yakın zamana kadar, bu çabalar gen fonksiyonu pertürbasyon güvenilir yöntemlerin eksikliği tarafından engellenir edildi. Ancak, transgenik metodoloji 1 gelişmesiyle birlikte, biz şimdi böyle kök hücre fonksiyonu, yenilenme ve desenlendirme gibi çok hücreli hayvanların, ortak temel mekanizmalarının daha iyi anlayabilmek için Hydra tam olarak yararlanmak mümkün. Transjenik hatlar Hydra yavru önemli bir frekans rasgele entegrasyon ve kimerik ifadesi ile embriyoların, plazmid DNA enjeksiyonu ile belirlenir. Belirli bir soy üniforma ifade ile bir çizgi eşeysiz çoğalması ile kurulabilir. Klonal Transg yaymak için yeteneğienic Hydra hatları sadece cinsel üreme tarafından yayılan olabilir hayvan modellerinin çoğunluğu, bir avantajdır. Buna ek olarak, transgenik hücreler nedeniyle hayvanın şeffaflık ve endojen floresan proteinleri 8 söz konusu olmaması nedeniyle in vivo kolayca izlenebilir.
İlk transgenik Hydra hatları yana yedi yıl içinde bu tür çizgiler, çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır, 1 yapılmıştır. Farklı hücre tipleri floresan proteinlerin sentezlenmesi mümkün, hücre hareketini takip hücre şekli değişiklikleri gözlemlemek ve vahşi tip koşullarda ve kimyasal pertürbasyondan 1,5,9-12 sonra her iki hücre kaderlerini izlemek için yaptı. Buna ek olarak, çeşitli soy farklı floresan protein sentezlenmesinin spesifik hücre popülasyonlarının FACS izolasyonu sağlar. Bu teknik, kök hücre spesifik mRNA ve seri spesifik küçük RNA 13,14 dizilenmesi için kullanılmıştır. Yükselticisi iseİki Hydra aktin genlerinden biri en yaygın olarak kullanılan bir kaç hücre tipi özel hızlandırıcılar tanımlanmış ve transgenik Hydra 9,11,15,16 GFP sentezlenmesini tahrik etmek için kullanılmaktadır. Gelecekte, hücre türüne özgü promoterler herhangi bir hücre tipi gözlem ve toplanmasını sağlayacak. Buna ek olarak, transgenik bir yaklaşım başarılı Wnt3 promoterinin 17 cis-hareket eden düzenleyici öğeleri tanımlamak için kullanılmıştır.
Hydra transgenik yöntemlerinin geliştirilmesi ektopik ekspresyonu aşırı ifadesi ve devirme ile genlerin fonksiyonunu test etmek için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Transgenik hayvanlar fonksiyonu ve hücresel lokalizasyonunu 18-20 hem de incelemek için floresan-etiketli proteinleri eksprese eden yapılmıştır. Buna ek olarak, bir GFP transgenin 3'UTR saç tokası RNA ekspresyonunun hedef genlerin 21,22 demonte yol açar. Bu yaklaşımların GFP tanımlamak için gereklive transgenik hattın oluşturulması sırasında transgenik doku izleyebilirsiniz. Bununla birlikte, bazı durumlarda GFP molekülü etiketli protein işlevine müdahale olasıdır. Yeni bir çalışma Nem genler operon konfigürasyonda düzenlenebilir gösterir, yani, daha sonra, polisistronik transkriptleri, trans-eklenmiş lider sıra ile ayrılmış ve ayrı ayrı 23 çevrildiği, yapılır. Bir protein veya bir operon ve aşağı doğru pozisyonda bir floresan protein geninin üst akış konumunda bir saç tokası RNA kodlayan bir geni yerleştirilerek, bir protein veya bir RNA firkete kodlayan geni etiketlemek zorunda olmayan transgenik doku izleyebilir. Bu yöntem, gen 14 demonte elde etmek için olan bir operasyon DsRed2 konfigürasyonunda bir saç tokası RNA ifade etmek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra rutin üretir asexually, ancak üreten garnetleri başlamak için çevresel uyaranlara gerektirir. Bu uyaranlar çoğu Hydra türler için iyi tanımlanmış değildir ve zorlanma zorlanma farklı olabilir. Cinsel olmak Hydra uyarılması için bir laboratuvar ortamında zor olabilir çünkü, transgenik Hydra üretimi için önemli bir engel düzenli olarak embriyolar elde etmektir. AEP 25 suşu, ancak, laboratuarda kolayca gamet üretir ve bu defa transgenik line…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma RESCEJ için HL için G. Harold & Leila Y. Mathers Ödülü ve bir NIH hibe (R24 GM080527) tarafından NRSA Doktora Sonrası Araştırmacı (NIH F32GM9037222) idi desteklenen ve şu anda Ulusal bir mentored Araştırmacı Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmektedir Yaşlanma Enstitüsü (K01AG04435). Biz yorumları için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| AEP Hydra Strain | NA | NA | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp |
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. . Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).
