Erzeugung transgener<em> Hydra</em> Durch Mikroinjektion Embryo

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

Hydra ist verwendet worden, um die Regeneration, Musterbildung zu studieren, und Stammzellen für etwa 250 Jahre ² Hydra hat eine einfache Körperplan, bestehend aus drei Zelllinien. Ektodermalen Epithelzellen, endodermalen Epithelzellen und interstitiellen. Der rohrförmige Körper wird von der ektodermalen und endodermalen Epithelzellen Abstammungslinien, von denen jede eine einzelne Zellschicht ausgebildet ist. Alle epithelialen Zellen im Körper Spalte mitotischen. Wenn Epithelzellen in den Extremitäten ³ verschoben wird, der Kopf (Mund und Tentakeln) in der mündlichen Ende oder dem Fuß (basal Scheibe) an der aboralen Ende, sie in der G2-Phase des Zellzyklus zu arretieren, und ändern Sie das Schicksal der Zelle ^4. Die Zellen der Zwischenlinie liegen in den Zwischenräumen zwischen den Epithelzellen. Diese Linie wird von multipotenten Stammzellen, die in der ektodermalen Epithelschicht des Körpers Spalte ⁵ angeordnet werden unterstützt. Die interstitielle Stammzellen führen zu drei somatische cell Typen (Nerven, Drüsenzellen, und nematocytes) und die Keimzellen ^6,7.

Als Mitglied des Stammes Cnidaria, die Schwestergruppe zu allen Bilateria, Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse unter vielzelligen Tiere geteilt vergießen. Bis vor kurzem waren diese Bemühungen durch das Fehlen zuverlässiger Verfahren zur Störung der Gen-Funktion behindert. Doch mit der Entwicklung transgener Methodik ^1, sind wir jetzt in der Lage, alle Vorteile der Hydra zu ergreifen, um ein besseres Verständnis der grundlegenden Mechanismen gemeinsam vielzelligen Tiere, wie der Stammzellfunktion, Regeneration und Strukturierung zu gewinnen. Transgene Hydra Linien werden durch Injektion von Plasmid-DNA in Embryonen, die in zufälliger Integration und chimären Ausdruck in einem wesentlichen Häufigkeit der Jungtiere führt gegründet. Eine Linie mit gleichmäßiger Expression in einem bestimmten Abstammungslinie kann durch asexuelle Vermehrung festgestellt werden. Die Fähigkeit, klonal transg propagierenENIC Hydra Linien ist ein Vorteil gegenüber der Mehrzahl von Tiermodellen, die nur durch sexuelle Reproduktion vermehrt werden können. Darüber hinaus können transgene Zellen in vivo leicht aufgrund der Transparenz des Tieres und der Abwesenheit von endogener Fluoreszenzproteine ^​​8 verfolgt werden.

In den sieben Jahren seit der ersten transgenen Hydra Linien wurden ¹ wie Linien für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Expression von fluoreszierenden Proteinen in verschiedenen Zelltypen hat es möglich gemacht, um die Zellbewegung zu verfolgen, Änderungen in der Zellform zu beobachten und zu verfolgen Zellschicksale sowohl in Wildtyp-Bedingungen und nach der chemischen Störung ^1,5,9-12. Darüber hinaus ermöglicht die FACS Isolierung von spezifischen Zellpopulationen, die Expression von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen in den verschiedenen Linien. Diese Technik wurde für die Sequenzierung von Stammzell-spezifischen mRNAs und linienspezifische kleinen RNAs ^13,14 eingesetzt. Während der Promotoreiner der beiden Hydra Aktin Gene wurde am häufigsten verwendet wird, eine spezifische Promo wenige Zelltyp wurden identifiziert und verwendet, um die Expression von GFP bei transgenen Hydra ^9,11,15,16 fahren. In Zukunft werden Zelltyp-spezifische Promotoren für die Beobachtung und Erfassung von spezifischen Zelltyp ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine transgene Ansatz erfolgreich verwendet, um die cis-wirkenden regulatorischen Elemente des Promotors Wnt3 ¹⁷ definieren.

Die Entwicklung transgener Methoden in Hydra bietet eine robuste Ansatz zum Testen der Funktion von Genen durch ektopische Expression, Überexpression und Knockdown. Transgenen Tieren vorgenommen wurden, die fluoreszenzmarkierte Proteine, um die Funktion und zelluläre Lokalisation ^18-20 untersuchen auszudrücken. Zusätzlich wurde die Expression von RNA-Haarnadeln in der 3'UTR des GFP-Transgens führt zu Knockdown von Zielgenen ^21,22. In diesen Ansätzen GFP ist erforderlich, um zu ermittelnund verfolgen die transgene Gewebe während der Erstellung der transgenen Linie. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass in einigen Fällen das GFP-Molekül würde mit der Funktion des markierten Proteins stören. Eine neuere Untersuchung zeigt, dass Hydra-Gene in einem Operon-Konfiguration angeordnet, das heißt, polycistronische Transkripte hergestellt, die dann durch Transspleißprodukte Führer zusätzlich getrennt und separat ²³ übersetzt werden. Mit der Abgabe eines Gens, das ein Protein oder eine RNA-Haarnadel in die Position stromaufwärts von einem Operon und ein fluoreszierendes Protein-Gen in der stromabwärtigen Position kodiert, kann eine transgene Gewebe, ohne den das Protein-oder RNA-Haarnadel-kodierende Gen Schiene. Diese Methode wurde verwendet, um eine RNA-Haarnadel in einem Operon Konfiguration mit DsRed2 um zu erreichen Gen-Knockdown ¹⁴ auszudrücken.

Protocol

1. Herstellung von Plasmid-DNA, Nadeln und Injektions Geschirr Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit einem High-Speed-Maxi oder Midi-Kit und konzentrieren die DNA auf 2,5 mg / ml mit Ethanol-Fällung. Das DNA-Pellet sollte in Nuklease-freiem deionisiertem Wasser gelöst werden. Speichern die DNA in 10-20 ul-Aliquots bei -20 ° C. (Siehe Zusatz Tabelle 1 für eine Liste der verfügbaren Vektoren) Machen Sie eine Spritz Gericht unter Verwendung von Agarose, eine Mulde zur Aufnahme Embryone…

Representative Results

Gründung transgenen Linien Hydra Jungtiere ernähren transgenen alle 2-3 Tage mit Artemia-Nauplien. Jungtiere manchmal nicht für ein oder zwei Tage zu essen nach dem Schlüpfen. Einige neue Jungtiere nie zu essen, und damit wird nicht überleben. Wenn das Jungtier ist entweder in der transgenen ektodermalen (Abbildung 1A) oder endodermalen Epithel, damit das Tier zu knospen und sammeln die Knospen, die den meisten transgenen Gewebe (Abbildung 1B, C)….

Discussion

Hydra routinemäßig reproduziert ungeschlechtlich, erfordert aber Umweltreize zu produzieren Gameten zu beginnen. Diese Stimuli werden für die meisten Arten Hydra gut definiert und kann von Stamm zu Stamm unterscheiden. Ein wesentliches Hindernis für die Herstellung von transgenen Hydra Erhalten Embryonen regelmäßig, weil es schwierig im Labor zu induzieren Hydra sexuelle geworden sein kann. Der AEP-Stamm ²⁵ erzeugt jedoch Gameten leicht im Labor und dies ist der einzi…

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151