عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
أن تكون قادرة على تحديد وقياس مستويات البروتين التعبير هو أسلوب القياسية لالحيواني والتجارب القائمة على الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الفائدة في وقت مبكر الجنينية تطوير صمام القلب، وتقييم البروتين التعبير في هذا النسيج محددة خلال تطوير يقتصر حاليا على المناعية في كل من الفرخ والفأر 1،2 طويل الأمد. جزء من صعوبة تحديد كمية البروتين التعبير في صمامات تطوير معظم الكائنات نموذج (مثل الفرخ والفأر) هو صغر حجم الصمامات، مما يحد من كمية البروتين التي يمكن الحصول عليها. وهكذا، على التحليلات الكمية، يعتمد الباحثون عادة على استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم PCR الكمي لاحقة أو تحليل ميكروأري 2-5. ومع ذلك، RNA والبروتين مستويات التعبير ليست المترابطة 6 بالكامل، بحيث يمكن التركيز على التعبير RNA لا توفر حساب دقيق للتغيرات العديدة التي تحدث في أي إشارات معينةالمسار في أوقات مختلفة خلال التطورات. واستنادا إلى هذا الحد في المنهجية المتاحة حاليا، وكان الهدف من هذا الإجراء لوضع بروتوكول للحصول موثوق كميات كافية من البروتين من الفأر الجنينية المناطق صمام القلب النامية من أجل التحليل الكمي للتغيرات التي تحدث في مختلف مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة في نضوج هذا النسيج.
وبالفعل تشريح الصمامات عادة من الفئران الجنينية لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل الجينات لاحق التعبير 2-5. ولكن هذه الدراسات اقتصرت على استخدام التعبير الجيني باعتبارها من قراءة إشارات من تفعيل المسار، والتي لا تسمح للكشف عن الكشف عن تعديلات البروتين بعد متعدية التي قد تؤثر إشارات المصب. باستخدام تقنيات العزل RNA كنقطة انطلاق، بدأنا مع تشريح المناطق ذات الأهمية. لأن مصلحتنا تم الكشف عن البروتينات فسفرته التي كانت مؤشرا يدل باتالنشاط hway خلال فترة محددة من تطوير الصمام الأورطي (E13.5-14.5)، أجرينا كل تشريح خالية من الفوسفات في تريس العازلة وجمع الصمامات في تحلل العازلة على أساس تريس، مع الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني. في حالتنا هذه، تم جمع المناطق صمام الأبهري فقط، ولكن يمكن بسهولة الحصول عليها المنطقة صمام رئوي في نفس الوقت. كانت المناطق صمام ثم متجانسة وجنبا إلى جنب مع عينة العازلة التي تستخدم حاليا لدراسة التعبير البروتين في صمامات القلب الكبار 7. باستخدام وحدات التخزين عينة صغيرة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر) وتجميع صمام المناطق من أجنة بنفس النمط الجيني، تمكنا من الكشف عن بروتينات فسفرته وnonphosphorylated في اليوم الجنينية 13.5 8. لأن المناطق صمام يمكن تجميدها وتخزينها في المخزن تحلل، يمكن التنميط الجيني لأجنة إذا لزم الأمر قبل تجميع.
هذه التقنية يوسع مجموعة من الأدوات المتوفرة لتقييم signalin خليةز مسارات خلال تطوير وتقدم مجاملة الكمية لالمناعية، وتحديدا لصمامات القلب النامية. وينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيدا ليس فقط لأطباء القلب التنموية ولكن أيضا لجميع علماء البيولوجيا التطورية الذين يعملون مع الأجنة مرحلة مبكرة يرغبون في المناطق التي تحتوي على الأنسجة محدودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على قياس مستويات البروتين في أوائل الفأر الجنينية وكتكوت المناطق صمام القلب توفر أداة إضافية لفهم الأحداث الإشارات الخلوية الحرجة للتنمية صمام. لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لا تختلف كثيرا من إجراءات عزل بروتين القياسية. ومع ذلك، عن طريق تعديل بعض الخطوات الر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
