Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Summary

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Abstract

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Introduction

Ser capaz de identificar e quantificar os níveis de expressão de proteínas é uma técnica padrão para sanidade animal e experimentos baseados em células. No entanto, apesar de um interesse de longa data no início do desenvolvimento embrionário da válvula cardíaca, avaliando a expressão da proteína neste tecido específico durante o desenvolvimento está actualmente limitada a imunohistoquímica, tanto a garota e rato ^1,2. Parte da dificuldade de se quantificar a expressão da proteína nas válvulas de desenvolvimento da maioria dos organismos-modelo (por exemplo, grão e do rato) é o tamanho pequeno das válvulas, o que limita a quantidade de proteína que pode ser obtida. Assim, para análise quantitativa, os pesquisadores geralmente dependem de extração de RNA e amplificação por PCR quantitativa ou posterior análise microarray ^2-5. No entanto, RNA e proteína níveis de expressão não são totalmente correlativo ^6, portanto, com foco na expressão do RNA não pode fornecer uma explicação rigorosa das inúmeras mudanças que ocorrem em qualquer sinalizaçãocaminho em vários momentos durante a evolução. Com base neste limite na metodologia actualmente disponível, o objectivo deste procedimento é de desenvolver um protocolo para a obtenção de forma fiável uma quantidade suficiente de proteína a partir das regiões de rato embrionário de válvula cardíaca em desenvolvimento para a análise quantitativa das alterações que ocorrem em diversas vias de sinalização que são importantes em a maturação deste tecido.

As válvulas são normalmente já embrionárias dissecados a partir de ratinhos para isolamento de ARN e a análise da expressão do gene posterior ^2-5. No entanto, estes estudos têm sido limitados a usar a expressão do gene como ler-out de sinalização da ativação da via, que não permite a detecção de detectar modificações pós-traducionais de proteínas que podem afetar a sinalização a jusante. Usando as técnicas de isolamento de RNA como um ponto de partida, que começou com dissecando as regiões de interesse. Porque o nosso interesse foi detectar proteínas fosforiladas que eram indicativos de sinalização patatividade HWAY durante um período específico de desenvolvimento da valva aórtica (E13.5-14.5), realizamos todas as dissecções em tampão Tris livre de fosfato e recolheu as válvulas em um tampão de lise baseada em Tris com inibidores da protease e fosfatase. No nosso caso, apenas as regiões de válvulas aórticas foram recolhidas, mas a região da válvula pulmonar pode ser facilmente obtida ao mesmo tempo. As regiões valvares, foram homogeneizadas e combinado com um tampão de amostra que está sendo usado para estudar a expressão da proteína em válvulas cardíacas adultas ^7. Usando pequenos volumes de amostras (por exemplo, 2 mL) e reunindo regiões de válvulas a partir de embriões com o mesmo genótipo, fomos capazes de detectar proteínas fosforiladas e não fosforilado no dia embrionário 13,5 ^8. Porque as regiões da válvula podem ser congeladas e armazenadas em tampão de lise, os embriões podem ser genotipados se necessário antes agrupamento.

Esta técnica amplia o conjunto de ferramentas que estão disponíveis para avaliar signalin celularg vias durante o desenvolvimento e fornece um elogio quantitativo de imuno-histoquímica, especificamente para as válvulas cardíacas em desenvolvimento. Esta técnica deve ser um benefício não só para os cardiologistas de desenvolvimento, mas também a todos os biólogos do desenvolvimento que trabalham com embriões em estágio inicial está interessado em regiões que contêm tecido limitado.

Protocol

NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. 1 Imposto de Válvula Aórtica Usando uma técnica de eutanásia aprovado para o estágio embrionário de interesse, a eutanásia um ratinho grávida com crias no dia embrionário desejado (E) de desenvolvimento. Usar 70% de etanol para esterilizar o abdómen da mulher grávida. Levante a pele e músculos do abdômen inferior…

Representative Results

Usando esta técnica de preparação, nós fomos capazes de detectar fosforilada Smad 1,5,8 (pSmad) nas regiões única válvula aórtica de E13.5 embriões. Como mostrado na Figura 1A, a proteína isolada a partir de mesmo uma única região de válvula é capaz de detectar uma banda pSmad fraco. A intensidade de sinal aumenta proporcionalmente com o número de regiões de válvula, que são reunidas. É importante notar que a relação pSmad / β-actina permanece quase constante entre os di…

Discussion

A capacidade de quantificar os níveis de proteína no início de rato embrionárias e Chick regiões da válvula cardíaca fornece uma ferramenta adicional para a compreensão dos eventos de sinalização celular críticos para o desenvolvimento da válvula. Nosso protocolo aqui descrito não diferem muito de procedimentos de isolamento de proteína padrão. No entanto, modificando alguns passos fundamentais, temos obtido sucesso proteínas fosforiladas de extremamente pequenas amostras. Para alcançar este resultado, …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Timed-pregnant mouse			To be dissected at the embryonic stage of interest
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Fine forceps, #5	Fine Science Tools	11251-30
Dissecting needle holders	Ted Pella Inc.	13560
Dissecting needles	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 μl, with tips
Lysis buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Stainless steel beads	Qiagen	69989
Microcentrifuge