Proteinisolering fra udviklingslandene Embryonale Mouse hjerteklap Region

Summary

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Abstract

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Introduction

At være i stand til at identificere og kvantificere proteinekspressionsniveauer er en standard teknik til dyre- og cellebaserede forsøg. Men på trods af en mangeårig interesse i den tidlige embryonale hjerteklap udvikling, evaluering protein ekspression i denne specifikke væv under udvikling i øjeblikket er begrænset til immunhistokemi i både kylling og mus ^1,2. En del af det er vanskeligt at kvantificere protein-ekspression i udviklingslandene ventiler fleste modelorganismer (f.eks chick og mus) er den lille størrelse af de ventiler, der begrænser mængden af protein, der kan opnås. Således til kvantitative analyser, forskere typisk afhængige RNA-ekstraktion og forstærkning for efterfølgende kvantitativ PCR eller microarray analyse ^2-5. Men RNA og protein ekspressionsniveauer ikke er fuldstændigt korreleret ^6, så fokus på RNA-ekspression kan ikke give en streng hensyn til de talrige ændringer, der opstår i en given signaleringvej på forskellige tidspunkter under udviklingen. På baggrund af denne grænse i den aktuelt tilgængelige metode, målet med denne fremgangsmåde var at udvikle en protokol til pålideligt at få tilstrækkelige mængder af protein fra udviklingslandene embryonale muse hjerteklap regioner til kvantitativ analyse af forandringer, der sker i forskellige signalveje, der er vigtige i modning af dette væv.

Embryonale ventiler er allerede almindeligt dissekeret fra mus til RNA-isolering og efterfølgende genekspressionsanalyse ^2-5. Imidlertid har disse undersøgelserne været begrænset til at bruge genekspression som en udlæsning af signalvejen aktivering, som ikke tillader påvisning af opdage posttranslationelle protein ændringer, der kan påvirke downstream-signalering. Brug af RNA-isolationsteknikker som udgangspunkt, vi begyndte med at dissekere de områder af interesse. Fordi vores interesse var påvisning phosphorylerede proteiner, der var betegnende for signalering patHway aktivitet i en bestemt periode aortaklappen udvikling (E13.5-14.5), udførte vi alle dissektioner i fosfat-fri Tris-buffer og indsamlet ventilerne i en Tris-baserede lyseringspuffer med phosphatase og proteasehæmmere. I vores konkrete tilfælde, kun aortaklappen regioner blev indsamlet, men det pulmonale ventil regionen kunne let opnås på samme tid. Ventilens regioner blev derefter homogeniseret og kombineret med en prøve buffer, der i øjeblikket anvendes til at studere protein-ekspression i voksne hjerteklapper ^7. Ved at bruge små prøvevolumener (f.eks 2 ul) og samle ventil regioner fra embryoner med samme genotype, var vi i stand til at opdage phosphorylerede og nonphosphoryleret proteiner ved embryonal dag 13,5 ^8. Fordi ventil regioner kan fryses og opbevares i lysisbuffer kan embryoner genotypebestemme hvis det er nødvendigt før pooling.

Denne teknik udvider sæt værktøjer, der er tilgængelige for at vurdere celle signaling veje under udviklingen, og giver en kvantitativ kompliment til immunhistokemi, specielt til udviklingslandene hjerteklapper. Denne teknik bør være til gavn ikke blot for udviklingsmæssige kardiologer, men også for alle udviklingsmæssige biologer, der arbejder med embryoer tidlige er interesseret i regioner, der indeholder begrænsede væv.

Protocol

BEMÆRK: Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of North Carolina i Chapel Hill. 1. Excise aortaklappen Ved hjælp af en godkendt eutanasi teknik til fosterstadiet af interesse, aflive en gravid mus med unger på det ønskede embryonale dag (e) i udvikling. Brug 70% ethanol for at sterilisere maven af ​​gravide kvinder. Løft hud og muskel i underlivet op og væk fra de indre organer, og dissekere åbne kvindelige nedre …

Representative Results

Ved hjælp af dette præparat teknik, var vi i stand til at detektere phosphoryleret Smad 1,5,8 (pSmad) i enkelte aortaklappen regioner fra E13,5 embryoner. Som vist i figur 1A, proteinet isoleres fra selv en enkelt ventil region er tilstrækkeligt til at påvise en svagt pSmad bånd. Signal intensitet stiger proportionalt med antallet af ventil regioner, der er medtaget. Vigtigere er det, pSmad / β-actin procentdel fortsat næsten konstant på tværs af de forskellige stikprøvestørrelser …

Discussion

Evnen til at kvantificere protein niveauer i den tidlige embryonale mus og chick hjerteklapperne regioner giver en ekstra redskab til at forstå de kritiske cellulære signalering begivenheder for ventil udvikling. Vores protokol beskrevet heri adskiller sig ikke væsentligt fra standard proteinisolerings- procedurer. Men ved at ændre nogle af de vigtigste skridt, vi har med succes fået phosphorylerede proteiner fra ekstremt små stikprøvestørrelser. For at opnå dette resultat, kan følgende trin er af særlig bety…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Timed-pregnant mouse			To be dissected at the embryonic stage of interest
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Fine forceps, #5	Fine Science Tools	11251-30
Dissecting needle holders	Ted Pella Inc.	13560
Dissecting needles	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 μl, with tips
Lysis buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Stainless steel beads	Qiagen	69989
Microcentrifuge