Protein Isolering från utvecklings Embryonala Mus hjärtklaff Region

Summary

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Abstract

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Introduction

Att kunna identifiera och kvantifiera proteinexpressionsnivåer är en standardteknik för djur- och cellbaserade experiment. Trots ett långvarigt intresse för tidig embryonal hjärtklaff utveckling, utvärdering proteinuttryck i detta specifika vävnad under utveckling är för närvarande begränsad till immunhistokemi i både brud och mus ^1,2. En del av svårigheten att kvantifiera proteinuttryck i utvecklings ventiler av de flesta modellorganismer (t.ex. chick och mus) är den lilla storleken av ventilerna, vilket begränsar den mängd protein som kan erhållas. Således, för kvantitativa analyser, forskare grundar sig oftast på RNA-extraktion och amplifiering för efterföljande kvantitativ PCR eller microarray analys ^2-5. Men RNA och proteinexpressionsnivåer inte är helt korrelat ^6, så fokusera på RNA-uttryck kan inte ge en rigorös beakta de många förändringar som sker i en viss signaleringväg vid olika tidpunkter under utvecklingen. Baserat på denna gräns i tillgängliga metoden, var målet för den här proceduren för att utveckla ett protokoll för tillförlitligt erhålla tillräckliga mängder protein från utvecklings embryonala mus hjärtklaffregioner för kvantitativ analys av förändringar som sker i olika signalvägar som är viktiga i mognaden av denna vävnad.

Embryonala ventiler är redan allmänt dissekeras från möss för RNA-isolering och efterföljande genuttrycksanalys ^2-5. Emellertid har dessa studier varit begränsad till att använda genuttryck som en avläsning av signalväg aktivering, som inte tillåter att upptäcka upptäcka posttranslationprotein modifieringar som kan påverka nedströms signalering. Använda RNA isoleringstekniker som utgångspunkt började vi med att dissekera de områden av intresse. Eftersom vårt intresse var att upptäcka fosforylerade proteiner som var vägledande för signalering patHway aktivitet under en viss period av aortaklaffen utveckling (E13.5-14.5) utförde vi alla dissektioner i fosfatfria Tris-buffert och samlas ventilerna i en Tris-baserad lysbuffert med fosfatas och proteashämmare. I vårt speciella fall endast aortaklaffen regioner uppsamlades, men pulmonalisventil regionen kunde enkelt erhållas samtidigt. Ventil regioner homogeniserades sedan och kombinerades med en provbuffert som för närvarande används för att studera proteinuttryck i vuxna hjärtklaffar ^7. Genom att använda små provvolymer (t.ex. 2 pl) och samla ventil regioner från embryon med samma genotyp, kunde vi upptäcka fosforylerade och nonphosphorylated proteiner på embryonala dag 13,5 ^8. Eftersom ventil regioner kan frysas och lagras i lysbuffert, kan embryona genotypas om det behövs före sammanslagning.

Denna teknik breddar uppsättning verktyg som är tillgängliga för utvärdering av cell signaling vägar under utveckling och ger ett kvantitativt komplement till immunohistokemi, speciellt för utvecklingshjärtklaffar. Denna teknik bör vara till nytta inte bara för utvecklings kardiologer utan även alla utvecklingsbiologer som arbetar med embryon i tidiga skeden är intresserade av områden som innehåller begränsade vävnad.

Protocol

OBS: Alla experiment har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of North Carolina i Chapel Hill. 1. Punktaortaklaffen Genom att använda en godkänd dödshjälp teknik för fosterstadiet av intresse, avliva en gravid mus med valpar på önskad embryonala dag (E) i utvecklingen. Använd 70% etanol för att sterilisera buken av den gravida kvinnan. Lyft huden och musklerna i nedre delen av magen upp och bort från de inre organen, …

Representative Results

Med hjälp av detta preparat teknik, kunde vi upptäcka fosforyleras Smad 1,5,8 (pSmad) i enkla aortaklaff regioner från E13.5 embryon. Såsom visas i figur 1A, är tillräcklig för att detektera en svag pSmad bandet proteinet som isolerats från en enda ventil regionen. Signalnivån ökar proportionellt med antalet ventil regioner som slås samman. Viktigt är att pSmad / β-aktin talet fortfarande nästan konstant i de olika urvalsstorlekar (Figur 1C). På grund av de lå…

Discussion

Förmågan att kvantifiera proteinnivåer i tidig embryonal mus och chick hjärtklaffregioner ger ytterligare ett verktyg för att förstå de kritiska cellulära signalerings händelser för ventilutveckling. Vår protokoll beskrivs här skiljer sig inte mycket från vanliga proteinisoleringsförfaranden. Men genom att ändra några viktiga steg, vi har framgångsrikt fått fosforylerade proteiner från extremt små provstorlekar. För att uppnå detta resultat, följande steg är av särskild betydelse. För att säke…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Timed-pregnant mouse			To be dissected at the embryonic stage of interest
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Fine forceps, #5	Fine Science Tools	11251-30
Dissecting needle holders	Ted Pella Inc.	13560
Dissecting needles	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 μl, with tips
Lysis buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Stainless steel beads	Qiagen	69989
Microcentrifuge