Dans cet article, vidéo, on décrit la synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules.
La fourniture exogène d'un ARN messager codant synthétique (ARNm) pour l'induction de la synthèse des protéines dans les cellules souhaitées a un potentiel énorme dans les domaines de la médecine régénérative, la biologie de la cellule de base, le traitement de maladies, et la reprogrammation de cellules. Ici, nous décrivons une étape par étape de protocole pour la production de l'ARNm modifié avec un potentiel d'activation immunitaire réduite et une meilleure stabilité, le contrôle de la qualité de l'ARNm produit, la transfection de cellules avec de l'ARNm et de la vérification de l'expression de la protéine induite par cytométrie en flux. Jusqu'à 3 jours après une seule transfection avec eGFP ARNm, les cellules HEK 293 transfectées produisent eGFP. Dans cet article, la vidéo, la synthèse de l'ARNm eGFP est décrite à titre d'exemple. Cependant, la procédure peut être appliquée à la production de l'ARNm d'autres souhaités. Utilisation de la synthèse de l'ARNm modifié, les cellules peuvent être amenés à exprimer transitoirement les protéines désirées, dont ils ne seraient normalement pas exprimer.
Dans les cellules, la transcription de l'ARN messager (ARNm) et la traduction de l'ARNm en suivant protéines désirées assurer le bon fonctionnement des cellules. Troubles génétiques héréditaires ou acquis peuvent conduire à la synthèse insuffisante et dysfonctionnel de protéines et provoquer des maladies graves. Ainsi, une nouvelle approche thérapeutique pour induire la production de protéines manquantes ou défectueuses est exogène de la livraison synthétique modifié ARNm dans des cellules, qui code pour la protéine désirée. Ainsi, les cellules sont déclenchées à synthétiser des protéines fonctionnelles, dont ils ne peuvent normalement pas produire ou seraient naturellement pas besoin. En utilisant cette approche, des troubles génétiques peuvent être corrigés par introduction de l'ARNm qui code pour la protéine défectueuse ou manquante 1. Le traitement de l'ARNm peut également être utilisé pour la vaccination de synthétiser des antigènes protéiques qui sont exprimés par les cellules tumorales ou de pathogènes. De ce fait, le système immunitaire de l'hôte peut être activé afin d'éliminer efficacement les cellules tumorales ou prévenir infections 2,3. En outre, ces dernières années, l'ARNm a été utilisée avec succès pour générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP). A cet effet, les fibroblastes ont été transfectées avec des ARNm pour induire l'expression de facteurs de reprogrammation 4-6 et pour les convertir en iPSCs avec un énorme potentiel en médecine régénératrice.
Auparavant, l'utilisation de l'ARNm conventionnel a été associée à une faible stabilité et une forte immunogénicité. Ainsi, les applications cliniques des ARNm conventionnelles ont été limitées. Toutefois, le remplacement de la cytidine et l'uridine par la 5-méthylcytidine et pseudouridine intérieur de la molécule d'ARNm en Kariko et collègues rendu des molécules d'ARNm stables dans les fluides biologiques et de réduire considérablement l'activation immunitaire 10.7, ce qui permet maintenant l'applicabilité clinique de l'ARNm modifiés.
Utilisation ARNm modifiés produits par synthèse, les transcriptions de gènes souhaités peuvent être livrés temporairement in vivo 11ou in vitro pour induire l'expression de la protéine. L'ARNm est traduit introduit dans des conditions physiologiques par la machinerie de traduction cellulaire. En raison de l'absence d'intégration dans le génome de la cellule hôte par rapport à des vecteurs viraux pour la thérapie génique, le risque d'oncogenèse est empêché 12,13. Ainsi, la thérapie utilisant de l'ARNm synthétique modifié ira mieux acceptation clinique à l'avenir.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la production de l'ARNm modifié (figure 1), la transfection de cellules avec l'ARNm et de l'évaluation de l'expression des protéines dans les cellules transfectées.
La thérapie ARNm a un énorme potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, le traitement des maladies et la vaccination. Dans cette vidéo, nous démontrons la production d'un ARNm modifié stabilisée pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules. En utilisant ce protocole, d'autres ARNm souhaités peuvent être générés. La synthèse in vitro de l'ARNm modifié permet la transfection de cellules avec des ARNm désirées pour induire l'expression de …
The authors have nothing to disclose.
Ce projet a été financé par le Fonds social européen dans le Bade-Wurtemberg, Allemagne.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cell culture | |||
DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
FBS | Life Technologies | 10500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
Consumables | |||
Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
Plasmid amplification and purification | |||
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
mRNA production | |||
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
Transfection | |||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
Gel electrophoresis | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
1x TBE buffer | |||
Flow cytometry analyses | |||
CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
Equipment | |||
Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
CASY cell counter | Schärfe System | ||
Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
Bacterial incubator | Incutec | ||
Water bath | |||
ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
PCR thermocycler | Eppendorf | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | ||
Vortex | peqlab | ||
Thermomixer | Eppendorf | ||
Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
FACScan System | BD Biosciences | ||
Fluorescence microscope | Nikon | ||
Phase-contrast microscope | Zeiss |