In vitro Sintesi di mRNA modificata per l'induzione di espressione della proteina nelle cellule umane
Summary
In questo articolo video, si descrive la sintesi in vitro di mRNA modificata per l'induzione dell'espressione proteica nelle cellule.
Abstract
La consegna esogena di codifica messenger RNA sintetico (mRNA) per l'induzione della sintesi proteica nelle cellule desiderate ha un enorme potenziale nel campo della medicina rigenerativa, biologia cellulare di base, il trattamento di malattie e riprogrammazione delle cellule. Qui, descriviamo un passo per passo protocollo per la produzione di mRNA modificato con ridotto potenziale di attivazione immunitaria e una maggiore stabilità, controllo di qualità di prodotti mRNA, trasfezione di cellule con mRNA e la verifica della espressione proteica indotta mediante citometria a flusso. Fino a 3 giorni dopo una singola trasfezione con eGFP mRNA, le cellule HEK293 trasfettate producono eGFP. In questo articolo video, la sintesi di mRNA eGFP è descritto come esempio. Tuttavia, la procedura può essere applicata per la produzione di altri mRNA desiderati. Utilizzando il sintetico modificato mRNA, le cellule possono essere indotte ad esprimere transitoriamente le proteine desiderate, che normalmente non avrebbero esprimere.
Introduction
Nelle cellule, la trascrizione di RNA messaggero (mRNA) e la seguente traduzione di mRNA in proteine desiderate assicurare il corretto funzionamento delle cellule. Malattie genetiche ereditarie o acquisite possono portare a insufficiente e disfunzionale sintesi delle proteine e causare gravi malattie. Pertanto, un nuovo approccio terapeutico per indurre la produzione di proteine mancanti o difettosi è la consegna esogena di sintetica modificata mRNA in cellule, che codifica per la proteina desiderata. In tal modo, le cellule vengono attivate per sintetizzare le proteine funzionali, che normalmente non possono produrre o sarebbe naturalmente non hanno bisogno. Usando questo approccio, malattie genetiche possono essere corretti dalla introduzione di mRNA che codifica per la proteina difettosa o mancante 1. La terapia mRNA può essere utilizzato anche per la vaccinazione di sintetizzare antigeni proteici che sono espressi dalle cellule tumorali o patogeni. In tal modo, il sistema immunitario dell'ospite può essere attivato per eliminare efficacemente le cellule tumorali o impedire infeZIONI 2,3. Inoltre, negli ultimi anni, mRNA è stato usato con successo per generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). A tal fine, fibroblasti sono state trasfettate con mRNA di indurre l'espressione di fattori di riprogrammazione 4-6 e convertirli in iPSCs con un enorme potenziale in medicina rigenerativa.
In precedenza, l'uso di mRNA convenzionale è stata associata con scarsa stabilità e forte immunogenicità. In questo modo, le applicazioni cliniche di mRNA convenzionali erano limitate. Tuttavia, la sostituzione di citidina e uridina da 5-methylcytidine e pseudouridina all'interno della molecola di mRNA mediante Kariko e colleghi reso molecole di mRNA stabili nei fluidi biologici e drammaticamente ridotto attivazione immunitaria 7-10, che ora permette l'applicabilità clinica di mRNA modificati.
Utilizzando mRNA modificati sinteticamente prodotti, le trascrizioni del gene desiderato può essere recapitato temporaneamente in vivo 11o in vitro per indurre l'espressione della proteina. L'mRNA introdotto è tradotto in condizioni fisiologiche dalla macchina di traduzione cellulare. A causa della mancanza di integrazione nel genoma della cellula ospite, rispetto ai vettori di terapia genica virale, il rischio di oncogenesi è impedito 12,13. Pertanto, la terapia con mRNA sintetico modificato andrà meglio accettazione clinica nel futuro.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la produzione di mRNA modificato (Figura 1), trasfezione delle cellule con mRNA e la valutazione di espressione della proteina in cellule trasfettate.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia mRNA ha un enorme potenziale nel campo della medicina rigenerativa, il trattamento di malattie e vaccinazione. In questo video, dimostriamo la produzione di un mRNA modificato stabilizzata per l'induzione dell'espressione proteica nelle cellule. Usando questo protocollo, altri mRNA desiderati possono essere generati. La sintesi in vitro di mRNA modificato consente trasfezione di cellule con mRNA desiderati per indurre l'espressione di proteine bersaglio. In tal modo, la proteina des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal Fondo Sociale Europeo in Baden-Wuerttemberg, Germania.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| 0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
| 1x TBE buffer | |||
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss |
References
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