इस वीडियो लेख में, हम कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए संशोधित mRNA की इन विट्रो संश्लेषण का वर्णन.
वांछित कोशिकाओं में प्रोटीन संश्लेषण के शामिल होने के लिए सिंथेटिक मैसेंजर आरएनए (mRNA) कोडिंग के बहिर्जात वितरण पुनर्योजी दवा, बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान, रोगों के उपचार, और कोशिकाओं के reprogramming के क्षेत्र में अपार क्षमताएं हैं. यहाँ, हम प्रवाह cytometry द्वारा प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति की कम प्रतिरक्षा सक्रियण क्षमता और वृद्धि की स्थिरता, उत्पादन mRNA की गुणवत्ता नियंत्रण, कोशिकाओं के अभिकर्मक mRNA के साथ और सत्यापन के साथ संशोधित mRNA की पीढ़ी के लिए कदम प्रोटोकॉल से एक कदम का वर्णन. EGFP mRNA के साथ एक एकल अभिकर्मक के बाद 3 दिन तक, ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं EGFP उत्पादन. इस वीडियो लेख में, EGFP mRNA की संश्लेषण एक उदाहरण के रूप में वर्णित है. हालांकि, प्रक्रिया अन्य वांछित mRNA की उत्पादन के लिए लागू किया जा सकता है. MRNA के संशोधित सिंथेटिक का प्रयोग, कोशिकाओं क्षणिक वे सामान्य रूप से व्यक्त नहीं होता जो वांछित प्रोटीन, व्यक्त करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है.
कोशिकाओं में, मैसेंजर आरएनए का प्रतिलेखन (mRNA) और वांछित प्रोटीन में mRNA की निम्नलिखित अनुवाद कोशिकाओं के समुचित कार्य सुनिश्चित करते हैं. वंशानुगत या अधिग्रहीत आनुवंशिक विकार प्रोटीन की अपर्याप्त और बेकार संश्लेषण के लिए नेतृत्व और गंभीर बीमारियों का कारण बन सकता है. इस प्रकार, लापता या दोषपूर्ण प्रोटीन के उत्पादन को प्रेरित करने के लिए एक नया चिकित्सकीय दृष्टिकोण कोशिकाओं में mRNA संशोधित सिंथेटिक के बहिर्जात वितरण, वांछित प्रोटीन के लिए जो कोड है. इस प्रकार, कोशिकाओं वे सामान्य रूप से उत्पादन नहीं कर सकते या स्वाभाविक रूप से जरूरत नहीं होगी जो कार्यात्मक प्रोटीन, synthesize करने के लिए शुरू हो रहे हैं. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, आनुवंशिक विकार mRNA की शुरूआत से ठीक किया जा सकता है कि दोषपूर्ण या लापता प्रोटीन 1 के लिए कोड. mRNA के चिकित्सा भी ट्यूमर कोशिकाओं या रोगजनकों द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, जो प्रोटीन एंटीजन, synthetize को टीकाकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावी ढंग से ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने या infe को रोकने के लिए सक्रिय किया जा सकताctions 2,3. इसके अलावा, हाल के वर्षों में, mRNA के सफलतापूर्वक प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए, fibroblasts के reprogramming की अभिव्यक्ति 4-6 कारकों को प्रेरित करने के लिए और पुनर्योजी चिकित्सा में एक विशाल क्षमता के साथ IPSCs में उन्हें बदलने की mRNAs साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे.
इससे पहले, पारंपरिक mRNA की उपयोग कम स्थिरता और मजबूत प्रतिरक्षाजनकता के साथ जुड़े थे. इस प्रकार, पारंपरिक mRNAs का नैदानिक अनुप्रयोगों सीमित थे. हालांकि, Kariko और उनके सहयोगियों द्वारा mRNA के अणु के भीतर 5-methylcytidine और pseudouridine द्वारा cytidine और uridine के प्रतिस्थापन जैविक तरल पदार्थ में स्थिर mRNA के अणुओं गाया और नाटकीय रूप से अब संशोधित mRNAs का नैदानिक प्रयोज्यता की अनुमति देता है जो प्रतिरक्षा सक्रियण 7-10, कम कर दिया.
Synthetically का उत्पादन संशोधित mRNAs का प्रयोग, वांछित जीन टेप अस्थायी रूप से विवो 11 में दिया जा सकता हैया इन विट्रो में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए. पेश mRNA के सेलुलर अनुवाद मशीनरी द्वारा शारीरिक परिस्थितियों में अनुवाद किया है. कारण वायरल जीन थेरेपी वैक्टर की तुलना में मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण की कमी के कारण, oncogenesis का खतरा 12,13 रोका है. इस प्रकार, संशोधित सिंथेटिक mRNA का उपयोग चिकित्सा भविष्य में बेहतर नैदानिक स्वीकृति मिल जाएगी.
यहाँ, हम संशोधित mRNA की उत्पादन (चित्रा 1) mRNA के साथ कोशिकाओं और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की, अभिकर्मक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
mRNA के चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा, रोग और टीकाकरण के उपचार के क्षेत्र में जबरदस्त क्षमता है. इस वीडियो में, हम कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए एक स्थिर, संशोधित mRNA की उत्पादन प्रदर्शित ?…
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना Baden-Wuerttemberg, जर्मनी में यूरोपीय सामाजिक फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cell culture | |||
DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
FBS | Life Technologies | 10500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
Consumables | |||
Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202, 100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253 | |
Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
Plasmid amplification and purification | |||
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g l-1 in sterile water. |
LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g l-1 in sterile water. |
Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
mRNA production | |||
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
Transfection | |||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) with reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
Gel electrophoresis | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
0.5-10 kb RNA Ladder | Invitrogen | 15623-200 | |
1x TBE buffer | |||
Flow cytometry analyses | |||
CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´ | |
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´ | |
Equipment | |||
Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
CASY cell counter | Schärfe System | ||
Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
Bacterial incubator | Incutec | ||
Water bath | |||
ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
PCR thermocycler | Eppendorf | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | ||
Vortex | peqlab | ||
Thermomixer | Eppendorf | ||
Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
FACScan System | BD Biosciences | ||
Fluorescence microscope | Nikon | ||
Phase-contrast microscope | Zeiss |