In Vitro Syntese av Modified mRNA for Induksjon av Protein Expression i humane celler

Summary

I dette video artikkelen beskriver vi in vitro syntese av mRNA modifisert for induksjon av protein ekspresjon i celler.

Abstract

Den eksogene levering av koding syntetisk messenger-RNA (mRNA) for induksjon av proteinsyntese i ønskede celler har et enormt potensial innen regenerativ medisin, grunnleggende cellebiologi, behandling av sykdommer, og omprogrammering av celler. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for generering av modifiserte mRNA med redusert immunaktivering potensial og økt stabilitet, kvalitetskontroll av mRNA som produseres, transfeksjon av celler med mRNA og verifikasjon av det induserte proteinet ekspresjon ved strømningscytometri. Opp til 3 dager etter en enkelt transfeksjon med EGFP mRNA, de transfekterte HEK293 cellene produserer EGFP. I dette video artikkelen, er syntesen av EGFP-mRNA beskrevet som et eksempel. Imidlertid kan fremgangsmåten anvendes for fremstilling av andre ønskede mRNA. Ved hjelp av den syntetiske modifiserte mRNA, kan cellene bli indusert til forbigående å uttrykke de ønskede proteiner, som de normalt ikke ville uttrykke.

Introduction

I celler, transkripsjonen av messenger-RNA (mRNA) og den følgende translasjon av mRNA til ønskede proteiner sikrer riktig funksjon av celler. Arvelig eller ervervet genetiske lidelser kan føre til mangelfull og dysfunksjonell syntese av proteiner og forårsake alvorlige sykdommer. Således er en ny terapeutisk tilnærming for å indusere produksjonen av manglende eller defekte det eksogene proteiner levering av syntetisk modifisert mRNA i celler, som koder for det ønskede protein. Dermed blir cellene utløst å syntetisere funksjonelle proteiner, som de normalt ikke kan produsere eller ville naturligvis ikke trenger. Ved bruk av denne tilnærmingen, kan genetiske sykdommer korrigeres ved innføring av mRNA som koder for den defekte eller manglende protein ^1. MRNA-terapi kan også bli brukt for vaksinasjon for å syntetisere proteinantigener, som uttrykkes av patogener eller tumorceller. Derved kan vertens immunsystem aktiveres til effektivt å eliminere tumorceller eller forhindre infections ^2,3. Videre er det i de senere år, mRNA ble med hell anvendt for å generere induserte pluripotente stamceller (iPSCs). For dette formål, ble fibroblaster transfektert med mRNA for å indusere ekspresjon av reprogrammerings faktorer ^{til 4-6} og for å omdanne dem i iPSCs med et enormt potensiale i regenerativ medisin.

Tidligere var bruk av konvensjonelle mRNA forbundet med lav stabilitet og sterk immunogenisitet. Dermed ble kliniske anvendelser av konvensjonelle mRNA begrenset. Imidlertid, utskifting av cytidin og uridin med 5-metylcytidin og pseudouridine innenfor mRNA molekylet ved Kariko og kolleger gjengitt stabile mRNA molekyler i biologiske væsker og dramatisk redusert immunaktivering ^7-10, som nå tillater den kliniske anvendbarhet av modifiserte mRNA.

Ved hjelp av syntetisk produsert modifiserte mRNA, kan ønskede gentranskriptene bli midlertidig levert in vivo ¹¹eller in vitro til å indusere proteinekspresjon. Den innførte mRNA oversettes under fysiologiske betingelser oversettelsen av det cellulære maskineri. På grunn av mangel på integrasjon i vertscellegenomet i forhold til viral genterapi vektorer, er risikoen for onkogenese hindres ^12,13. Dermed vil terapi bruker modifiserte syntetiske mRNA bli bedre klinisk aksept i fremtiden.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for produksjon av modifisert mRNA (figur 1), transfeksjon av celler med mRNA og evaluering av protein ekspresjon i transfekterte celler.

Protocol

1. Økning av plasmider som inneholder Nødvendig Coding DNA-sekvenser (CDS) Pre-varm SOC medium, som er inkludert i transformasjons kit, til romtemperatur og LB-agarplater inneholdende 100 ug / ml ampicillin til 37 ° C. Ekvilibrere vannbad til 42 ° C. Tine ett hetteglass med kjemisk komponent E. coli på is. Legg 1-5 mL av plasmid (10 pg til 100 ng) som inneholder CDS inn i hetteglasset med kjemisk komponent E. coli og bland forsiktig. Ikke bland cellene ved pipetterin…

Representative Results

Ved hjelp av en pcDNA 3.3 plasmid inneholdende de CDS av EGFP, ble syntesen av modifiserte EGFP mRNA opprettet (figur 1). Etter at innsatsen amplifikasjon ved hjelp av PCR og poly T-tailing, er et klart bånd med en lengde på omtrent 1100 bp detektert (Figur 2). Økning av IVT tid utvidet utbyttet av mRNA (figur 3). Etter IVT, ble en klar mRNA bånd med en lengde på omtrent 1100 bp detekteres, noe som tilsvarer lengden av EGFP mRNA som skal fremstilles (figur …

Discussion

MRNA-terapi har et stort potensial i feltet av regenerativ medisin, behandling av sykdommer og vaksinasjon. I denne video, viser vi fremstilling av et stabilisert, modifisert mRNA for induksjon av protein ekspresjon i celler. Ved hjelp av denne protokollen, kan andre ønskede mRNA bli generert. In vitro syntese av mRNA modifisert tillater transfeksjon av celler med de ønskede mRNA for å indusere ekspresjon av målproteiner. Derved blir det ønskede protein uttrykt forbigående under fysiologiske betingelser t…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cell culture
DMEM, high glucose	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	100x
L-glutamine	PAA	M11-004	200 mM
DPBS without calcium and magnesium	PAA	E15-002
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Consumables
Tissue culture plates, 12-well	Corning	3512
Cell culture flask (75 cm2)	Corning	430641
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml conical tubes	greiner bio-one	188271
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips	Eppendorf	10 µl: 022491202,    100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture	BD Falcon	352059
Plasmid amplification and purification
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid	Addgene	26822
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Sterile water (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	Dissolve 25 g l-1 in sterile water.
LB agar (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	Dissolve 40 g l-1 in sterile water.
Ampicillin Ready Made Solution	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml
Glycerol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
mRNA production
HotStar HiFidelity Polymerase Kit	Qiagen	202602
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit	Life Technologies	AM1334
5-Methylcytidine-5´-triphosphate	Trilink	N1014	5-Methyl-CTP
Pseudouridine-5´-triphosphate	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µl
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit)
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
RNaseZap solution	Life Technologies	AM9780
Transfection
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668-019	Cationic lipid transfection reagent
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Invitrogen	11058-021	Improved Minimal Essential Medium (MEM) with  reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation
Gel electrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003	10,000x in water
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder	Peqlab	25-2210
0.5-10 kb RNA Ladder	Invitrogen	15623-200
1x TBE buffer
Flow cytometry analyses
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentrate
Primer for insert amplification and         poly (T) tail PCR
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´
Equipment
Cell incubator	Binder		CO2 (5%) and O2 (20%)
CASY cell counter	Schärfe System
Sterile workbench	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Bacterial incubator	Incutec
Water bath
ScanDrop spectrophotometer	Analytic Jena
PCR thermocycler	Eppendorf
Microcentrifuge	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
Gel apparatus for electrophoresis	Bio-Rad
Gel documentation system	Bio-Rad
FACScan System	BD Biosciences
Fluorescence microscope	Nikon
Phase-contrast microscope	Zeiss