Het manipuleren van de muizen traanklier
Summary
De traanklier (LG) is een vertakking orgaan dat de waterige componenten van tranen nodig produceert voor het behoud van de visie en de gezondheid van het oog. Hier beschrijven we muizen LG dissectie en ex vivo cultuur technieken te ontcijferen signaalwegen betrokken bij LG ontwikkeling.
Abstract
De traanklier (LG) scheidt waterige tranen noodzakelijk voor het behoud van de structuur en functie van het hoornvlies, een transparante weefsel essentieel zicht. In de menselijke bevindt één LG in de baan boven het laterale uiteinde van elk oog leveren tranen aan het oogoppervlak via 3-5 kanalen. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de exorbital traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor. Vergelijkbaar met andere glandulaire organen, LG ontstaat door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin één epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van knop en kanaal vorming een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en kanalen vormen. Dit ingewikkelde proces is goed gedocumenteerd in vele andere epitheliale organen zoals de pancreas en speekselklieren. Echter, heeft de LG veel minder bestudeerde geweest en de mechanismen die de morfogenese slecht onderstond. We vermoeden dat deze ondervertegenwoordiging als modelsysteem is een gevolg van de moeilijkheden die gepaard gaan met het vinden, ontleden en het kweken van de LG. Zo beschrijven we hier dissectie technieken voor het oogsten embryonale en postnatale LG en werkwijzen voor het ex vivo kweken van het weefsel.
Introduction
De traanklier (LG) is verantwoordelijk voor waterige traan secretie van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en de gezondheid, het onderhoud en de bescherming van de cellen van het oogoppervlak. LG disfunctie leidt tot een van de meest voorkomende en invaliderende oogaandoeningen: waterige deficiënte droge ogen ziekte, die wordt gekenmerkt door oculaire, lichtgevoeligheid en verminderd zicht 1. In de mens woont de LG in de baan boven de laterale einde van het oog, waar 3-5 afvoergangen aanbetaling tranen op het oogoppervlak. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor (exorbital) met scheuren die naar het oog via één kanaal excretie. Net als bij andere glandulaire organen, de LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin een enkel epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van bud en duct formatie voorm een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en leidingen (figuur 1) 2. Tijdens de ontwikkeling epitheel wordt gevasculariseerd en zwaar geïnnerveerd door parasympathische zenuwen van de pterygopalatine ganglion en in mindere mate van sympathische zenuwen van de superieure cervicale ganglion 3. Interacties tussen deze celtypen namelijk neuronale, epitheliale, endotheliale en mesenchymale cellen zijn essentieel voor de werking en het onderhoud van de volwassen weefsel. De onderliggende moleculaire mechanismen coördinatie LG ontwikkeling en regeneratie en hoe soort inter-cel leidt deze processen blijft onduidelijk.
De komst van embryonale ex vivo cultuur technieken heeft het mogelijk gemaakt de identificatie van de ontwikkeling en regeneratie van trajecten in meerdere vertakkingen organen 4. Kweken ex vivo geeft de onderzoeker de mogelijkheid om het orgaan te manipuleren (menische, genetische of chemische) onder gedefinieerde condities alsmede orgaanontwikkeling en cel-cel interacties te karakteriseren in real time. De exorbital LG van de muis is zeer vatbaar voor deze techniek en recente studies hebben gedefinieerd signaleringssystemen dat zijn ontwikkeling 2,5 reguleren. Ondanks de noodzaak van moleculaire signalen onderbouwing LG ontwikkeling en regeneratie begrijpen is nog steeds weinig bestudeerd waarschijnlijk door de technische problemen bij het isoleren van het orgaan. In dit artikel beschrijven we hoe te isoleren en uit te voeren ex vivo cultuur van de embryonale muizen LG om ontwikkelingsprogramma's te definiëren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De veelzijdigheid aan cultuur en manipuleren van de LG ex vivo biedt aanzienlijke voordelen voor het bestuderen van de ontwikkeling ervan. Dit omvat de snelheid waarmee de onderzoeker kan hypothesen en de veelheid van storingen die kunnen worden uitgevoerd om te beoordelen hoe epitheliale, neuronale, endotheliale cellen en mesencyhmal samenwerken om het orgaan te vormen testen. Er zijn echter een aantal restricties bij gebruik van dit model. Eerst op grond van de isolatie de klier is niet langer verbonden met d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag verstrekt door de UCSF Resource Allocation Program financiering erkennen.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. . Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
