マウス涙腺を操作する

Summary

涙腺（LG）は、ビジョンと眼の健康を維持するために必要な涙の水性成分を生成し、分岐器官である。ここでは、LG電子の開発に関与するシグナル伝達経路を解読するネズミLG郭清およびex vivo培養技術を説明しています。

Abstract

涙腺（LG）は、角膜の構造と機能、視力に不可欠な透明な組織を維持するために必要な水性涙を分泌する。 5ダクト – 人間では、単一のLGは3を通して眼表面に涙を配信するそれぞれの目の横端上記の軌道上に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、耳に眼窩外涙腺（LG）に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が分泌腺房とダクトの複雑な相互接続ネットワークを形成するために、つぼみとダクト形成の複数のラウンドを受けるものでは上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。この精巧なプロセスは、よくそのような膵臓および唾液腺などの多くの他の上皮の器官で文書化されています。しかし、LGはあまり検討されていると形態形成を制御するメカニズムは不完全に下です立っていた。我々は、このアンダー表現モデル系としては、見つけ解剖とLGを培養することに関連する困難の結果であることを疑う。したがって、ここでは解剖収穫胚および出生後のLGのための技術や組織のex vivo培養のための方法が記載されている。

Introduction

涙腺（LG）は、視力や健康、保守、および眼表面の細胞の保護のために重要なの水性涙液分泌を担当しています。眼の刺激、光感受性によって特徴づけられるとビジョン^1を減少させ、水性欠乏ドライアイ病、：最も一般的な衰弱性眼疾患の一つでLGの機能不全をもたらす。眼表面上に5排泄ダクト預金涙 – 人間ではLGが3目の側端より上の軌道に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、単一の排泄ダクトを経由して、目に涙を浮かべて旅行する耳（眼窩）へ涙腺（LG）に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が複数の芽のラウンドとするために、ダクトの形成を受けている上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発分泌腺房とダクトの複雑な相互接続されたネットワーク（ 図^1）2メートル。開発中は上皮は血管新生になるだけでなく、頻繁に翼口蓋神経節の副交感神経によって上頸神経節³から交感神経によってより少ない程度に神経支配。これらの細胞の種類すなわち神経細胞、上皮細胞、内皮細胞および間葉細胞のそれぞれとの間の相互作用は、成体組織の機能と維持に不可欠である。しかし、セル間タイプの通信は、これらのプロセスをガイドする方法と同様にLGの発達と再生を調整する基礎となる分子機構は依然として不明である。

胚のエクスビボで培養技術の出現は、複数の分岐臓器⁴の発達と再生経路の同定を可能にした。 ex vivoで培養する研究者を（私に臓器を操作する機能を提供しますリアルタイムでの臓器の発達および細胞 – 細胞相互作用を特徴付けるために、遺伝的または化学的）規定された条件下で同様に機械的、。マウスの眼窩LGがこの技術に非常に適していると最近の研究では、その開発^2,5を規制するシグナル伝達系を定義しました。しかし、LG電子の開発と再生を支える分子手がかりを理解する必要にもかかわらず、それは現在、原因臓器を単離する技術的困難に思わ代役のまま。本稿では、分離して発生プログラムを定義するために、胚ネズミLG のex vivo文化を実行する方法について説明します。

Protocol

全ての動物の作品は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨事項に厳密に従って下で行った。プロトコルは、カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）、サンフランシスコで承認された。 1.マウス胚性涙腺（LG）：収穫と顕微解剖 、科学研究倫理委員会のための制度の動物によって承認された手順に従うことで、適切な胚の?…

Representative Results

LG電子は、上皮分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。 E14、E15、E16、E17、およびP2で解剖胚自治体の明視野画像は、このイベントを説明する。 図1. LGは分枝形態形成上皮のプロセスを経て開発しています。新鮮にE14、E15、E16、E17およびP2で…

Discussion

文化への汎用性とex vivoで 、LGを操作は、その開発を研究するための重要な利点を提供します。これは、研究者の仮説と、神経、内皮およびmesencyhmal細胞は器官を形成するように相互作用する方法を、上皮評価することができる多数の摂動をテストすることができる速度を含む。このモデルを利用する場合しかし、警告の数が存在する。まず、その分離によって腺は、それらが神経や血?…

Materials

Name	Catalog #.	Company	Comments/Description
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1X PBS
Phosphate Buffered Saline 10X	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1X			Prepared from 10X stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.
BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
			Ideal for harvesting glands from embryos
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.