המניפולציה Murine דמעות בלוטת
Summary
בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.
Abstract
בלוטת הדמעות (LG) מפרישה דמעות מימיות הכרחיות לשמירה על המבנה והתפקוד של הקרנית, רקמה שקופה חיונית לראייה. באדם LG יחיד מתגורר במסלול מעל הקצה לרוחב של כל עין ומספקת דמעות על פני השטח של העין באמצעות 3 – 5 צינורות. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת דמעות exorbital הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור כדי ליצור רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה. תהליך מורכב זה תועד היטב באיברים רבים אפיתל אחרים כגון הלבלב ובלוטות רוק. עם זאת, LG היה הרבה פחות חקר ומנגנוני השליטה המורפוגנזה הם גרוע תחתעמד. אנו חושדים כי תת-ייצוג זה כמערכת מודל הוא תוצאה של הקשיים הקשורים במציאה, לנתח וculturing LG. לכן, כאן אנו מתארים טכניקות לנתיחה לעובריים קציר ולאחר הלידה LG ושיטות לתרבות vivo לשעבר של הרקמה.
Introduction
בלוטת הדמעות (LG) היא אחראית להפרשת דמעות מימית קריטית לחדות ראייה והבריאות, תחזוקה, והגנה על התאים של פני השטח העין. תוצאות תפקוד לקוי של LG באחת מההפרעות עיניות הנפוצות והמתישות ביותר: יבשים חסר מימית מחלות עיניים, אשר מאופיינת על ידי גירוי עיני, רגישות לאור וירידה בראייה 1. באדם LG מתגורר במסלול מעל הקצה הלטרלי של העין שבו 3 – 5 דמעות הפקדת צינוריות הפרשה על פני השטח של העין. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת הדמעות הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן (exorbital) עם דמעות בנסיעות לעין באמצעות צינור הפרשה אחד. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור למ 'רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה (איור 1) 2. במהלך פיתוח האפיתל הופך כלי דם, כמו גם בכבדות innervated על ידי העצבים הפאראסימפתטית של גנגליון pterygopalatine ומידה פחותה יותר על ידי עצבים סימפטיים מצוואר רחם הגנגליון מעולה 3. יחסי גומלין בין כל אחד מהתאים האלה סוגים כלומר תאים עצביים, אפיתל, אנדותל וmesenchymal, חיוניים לתפקוד ולתחזוקה של הרקמות בוגרות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס תיאום פיתוח LG והתחדשות כמו גם איך תקשורת בין-סוג התא מנחה תהליכים אלה עדיין לא ברורים.
כניסתו של עוברי לשעבר טכניקות תרבות vivo אפשרה זיהוי של מסלולים התפתחותיים ומשובים באיברי הסתעפות מרובים 4. Culturing ex vivo נותן החוקר היכולת לתפעל את האיבר (chanical, גנטי או כימי) בתנאים מוגדרים, כמו גם לאפיין אינטראקציות התפתחות איברים ותאי תאים בזמן אמת. LG exorbital של העכבר הוא נוח מאוד בטכניקה זו ומחקרים שנעשו לאחרונה הוגדרו מערכות אזעקה המווסתות את התפתחותה 2,5. עם זאת, על אף הצורך להבין רמזים מולקולריים שבבסיס התפתחות LG והתחדשות, זה כרגע נשאר understudied, ככל הנראה בשל הקשיים הטכניים בבידוד האיברים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולבצע תרבות vivo לשעבר של LG העכברי העוברי להגדיר תוכניות התפתחותיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
צדדיות לתרבות ולתפעל את LG vivo לשעבר מספק יתרונות משמעותיים ללימוד הפיתוח שלה. זה כולל את המהירות שבה החוקר הוא מסוגל לבחון השערות והריבוי של הפרעות שניתן לבצע כדי להעריך עד כמה אפיתל, עצבי, אנדותל ותאי mesencyhmal אינטראקציה ליצירת האיברים. עם זאת, ישנם מספר סייגים כאש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות מימון הניתן על ידי התכנית להקצאת משאבי קליפורניה בסן פרנסיסקו.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. . Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
