Murine अश्रु ग्रंथि जोड़ तोड़
Summary
अश्रु ग्रंथि (एलजी) दृष्टि और नेत्र स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए आवश्यक आँसू की जलीय घटकों का उत्पादन एक शाखाओं में बंटी अंग है. यहाँ हम एलजी विकास में शामिल रास्ते संकेत समझने के लिए murine एलजी विच्छेदन और पूर्व vivo संस्कृति तकनीकों का वर्णन है.
Abstract
अश्रु ग्रंथि (एलजी) कॉर्निया की संरचना और समारोह, दृष्टि के लिए आवश्यक एक पारदर्शी ऊतक बनाए रखने के लिए आवश्यक जलीय आँसू स्रावित करता है. 5 नलिकाओं – मानव में एक भी एलजी 3 के माध्यम से नेत्र सतह पर आँसू पहुंचाने प्रत्येक आंख के पार्श्व अंत से ऊपर की कक्षा में रहता है. माउस प्रमुख नेत्र ग्रंथियों के तीन जोड़े की है, जिनमें से अधिकांश का अध्ययन कान को exorbital अश्रु ग्रंथि (एलजी) स्थित पूर्वकाल और उदर है. अन्य ग्रंथियों के अंगों के लिए इसी प्रकार, एलजी एक गाढ़ा mesenchyme के भीतर एक भी उपकला कली स्रावी acini और नलिकाओं की एक जटिल परस्पर नेटवर्क के रूप में कली और वाहिनी के गठन के कई दौर आए जिसमें उपकला शाखाओं में बंटी morphogenesis की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करता है. इस व्यापक प्रक्रिया को अच्छी तरह से अग्न्याशय और लार ग्रंथि के रूप में कई अन्य उपकला अंगों में दर्ज़ किया गया है. हालांकि, एलजी बहुत कम पता लगाया गया है और morphogenesis नियंत्रित तंत्र खराब तहत कर रहे हैंखड़ा था. हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में यह कम प्रतिनिधित्व, ढूँढने विदारक और एलजी संवर्धन के साथ जुड़े कठिनाइयों का परिणाम है कि संदेह है. इस प्रकार, यहाँ हम विच्छेदन कटाई भ्रूण और प्रसवोत्तर एलजी के लिए तकनीक और ऊतक के पूर्व vivo संस्कृति के लिए विधियों का वर्णन.
Introduction
अश्रु ग्रंथि (एलजी) दृश्य तीक्ष्णता और स्वास्थ्य, रखरखाव, और नेत्र सतह की कोशिकाओं के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण जलीय आंसू स्राव के लिए जिम्मेदार है. आंख में जलन, प्रकाश संवेदनशीलता की विशेषता है और दृष्टि 1 की कमी हुई है जो जलीय कमी सूखी नेत्र रोग,: सबसे आम और कमजोर कर देने वाली नेत्र विकारों में से एक में एलजी शिथिलता का परिणाम है. मानव में एलजी आँख के पार्श्व अंत से ऊपर की कक्षा में रहता है जहां 3 – नेत्र सतह पर 5 निकालनेवाला नलिकाओं जमा आँसू. माउस प्रमुख नेत्र ग्रंथियों के तीन जोड़े की है, जिनमें से अधिकांश का अध्ययन एक ही मल त्यागने वाहिनी के माध्यम से आँख के लिए यात्रा आँसू के साथ कान (exorbital) को अश्रु ग्रंथि (एलजी) स्थित पूर्वकाल और उदर है. अन्य ग्रंथियों के अंगों के लिए इसी प्रकार, एलजी एक गाढ़ा mesenchyme के भीतर एक भी उपकला कली कई कली का दौर और के लिए करने के लिए वाहिनी के गठन की प्रक्रिया में जो उपकला शाखाओं में बंटी morphogenesis की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करता है(चित्रा 1) स्रावी acini और नलिकाओं की एक जटिल परस्पर नेटवर्क मी 2. विकास के दौरान उपकला vascularized हो जाता है साथ ही भारी के रूप में बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि 3 से सहानुभूति नसों से pterygopalatine नाड़ीग्रन्थि की परानुकंपी नसों से और एक हद तक कम करने के लिए innervated. प्रकार न्यूरोनल, उपकला, endothelial और mesenchymal कोशिकाओं यानी इन कोशिकाओं में से प्रत्येक के बीच बातचीत, समारोह और वयस्क ऊतक के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, अंतर-सेल प्रकार संचार इन प्रक्रियाओं गाइड कैसे और साथ ही एलजी विकास और उत्थान समन्वय अंतर्निहित आणविक तंत्र अस्पष्ट बनी हुई है.
भ्रूण पूर्व vivo संस्कृति तकनीक के आगमन के कई शाखाओं में बंटी अंगों 4 में विकास और पुनर्योजी रास्ते की पहचान की अनुमति दी है. पूर्व vivo संवर्धन शोधकर्ता (मेरे अंग में हेरफेर करने की क्षमता देता हैchanical, आनुवंशिक या रासायनिक) परिभाषित शर्तों के तहत के साथ ही वास्तविक समय में अंग विकास और सेल सेल बातचीत विशेषताएँ. माउस के exorbital एलजी इस तकनीक को अत्यधिक उत्तरदायी है और हाल के अध्ययनों से इसके विकास 2,5 विनियमित प्रणाली है कि संकेत को परिभाषित किया है. हालांकि, एलजी विकास और उत्थान underpinning आणविक संकेतों को समझने की जरूरत के बावजूद, यह वर्तमान की संभावना की वजह से अंग अलग में तकनीकी कठिनाइयों को, understudied बनी हुई है. इस पत्र में, हम अलग और विकास कार्यक्रमों को परिभाषित करने के लिए भ्रूण murine एलजी के पूर्व vivo संस्कृति को करने के लिए क्या करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति के लिए बहुमुखी प्रतिभा और एलजी पूर्व vivo इसके विकास के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हेरफेर. इस शोधकर्ता परिकल्पना और, न्यूरोनल, endothelial और mesencyhmal कोशिकाओं अंग के लिए फार्म बातचीत कैसे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों UCSF संसाधन आबंटन कार्यक्रम द्वारा प्रदान की जाने वाली फंडिंग स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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