Manipulera Murin tårkörteln

Summary

Tårkörteln (LG) är en förgrenings organ som producerar de vattenbaserade komponenter i tårar som krävs för att upprätthålla syn och ögonhälsa. Här beskriver vi mus LG dissektion och ex vivo odlingstekniker för att dechiffrera signalvägar involverade i LG utveckling.

Abstract

Tårkörteln (LG) utsöndrar vatten tårar som krävs för att upprätthålla struktur och funktion på hornhinnan, en transparent vävnad viktigt för vision. I människan en enda LG ligger i omloppsbana ovanför sidoänden av varje öga levererar tårar till den okulära ytan genom 3 – 5 kanaler. Musen har tre par stora okulära körtlar, den mest studerade av dessa är exorbital tårkörteln (LG) belägna främre och ventrala till örat. I likhet med andra körtel organ, LG utvecklas genom processen att epitel förgrening morfogenes i vilka en epitelial knopp i en kondenserad mesenkymet genomgår flera omgångar av linda och kanalbildning för att bilda ett intrikat sammankopplat nätverk av sekretorisk acini och kanaler. Denna genomarbetade process har dokumenterats väl i många andra epiteliala organ såsom bukspottkörteln och spottkörteln. Däremot har LG varit betydligt mindre utforskade och de mekanismer som styr morphogenesis är dåligt istod. Vi misstänker att detta underrepresentation som modellsystem är en följd av de svårigheter som är förknippade med att hitta, dissekera och odling av LG. Alltså, här beskriver vi dissektion tekniker för skörd embryonala och postnatal LG och metoder för ex vivo odling av vävnaden.

Introduction

Tårkörteln (LG) är ansvarig för vatten tårsekretion avgörande för synskärpa och hälsa, underhåll och skydd av cellerna i ögats yta. LG dysfunktion leder till en av de vanligaste och försvagande ögonsjukdomar: vatten bristfällig Torra ögon sjukdom, som kännetecknas av ögonirritation, ljuskänslighet och försämrad synskärpa ^1. I människan LG ligger i omloppsbana ovanför sido änden av ögat där 3-5 utförsgångar inlånings tårar har laddats in i ögats yta. Musen har tre par stora okulära körtlar, den mest studerade av dessa är tårkörteln (LG) belägna främre och ventrala för örat (exorbital) med tårar som reser till ögat via en enda utskiljningskanal. I likhet med andra körtel organ, LG utvecklas genom processen att epitel förgrening morfogenes i vilka en epitelial knopp i en kondenserad mesenkymet genomgår flera omgångar av knopp och kanalbildning till förm ett intrikat sammankopplat nätverk av sekretorisk acini och kanaler (figur 1) ^2. Under utvecklingen epitelet blir vaskulariserad liksom tungt innerveras av de parasympatiska nerverna i pterygopalatine ganglion och i mindre utsträckning av sympatiska nerver från den överlägsna cervikala ganglion ^3. Interaktioner mellan var och en av dessa celler typer dvs neuronala, epitelceller, endotelceller och mesenkymala celler, är avgörande för funktion och underhåll av vuxen vävnad. Men de bakomliggande molekylära mekanismer samordning LG utveckling och förnyelse samt hur inter celltyp kommunikation styr dessa processer är fortfarande oklart.

Tillkomsten av embryonala ex vivo odlingstekniker har möjliggjort identifiering av utvecklingsstörningar och regenerativa vägar i flera förgrenings organ ^4. Odling ex vivo ger forskaren möjlighet att manipulera orgeln (migmekanisk, genetisk eller kemisk) under definierade förhållanden och för att karakterisera utveckling orgel och cell-cell interaktioner i realtid. Den exorbital LG av musen är mycket mottaglig för denna teknik och nya studier har definierat signalsystem som reglerar dess utveckling ^2,5. Trots behovet av att förstå molekylära signaler som ligger till grund LG utveckling och förnyelse, för närvarande är det fortfarande understudied, sannolikt på grund av de tekniska svårigheterna att isolera orgeln. I detta dokument beskriver vi hur du isolerar och utföra ex vivo kultur embryonala murina LG att definiera utvecklingsprogrammen.

Protocol

Alla djur har gjorts med strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of California, San Francisco. 1. Mouse embryonala tårkörtlar (LG): Skörd och Microdissection Efter förfaranden som godkänts av Institutional djur för vetenskapliga forskningsetisk kommitté, euthanize tids gravida CD-1 (eller…

Representative Results

LG utvecklas genom processen epitel förgrening morfogenes. Bright bilder av embryonala LGs dissekerade vid E14, E15, e16, e17, och P2 visar denna händelse. Figur 1. LG utvecklas genom processen epitel förgrening morfogenes. Bright bilder av embryonala LGs nyligen dissekeras på E14, E15, e16, E17 och P2. <a href="https://ww…

Discussion

Mångsidig till kultur och manipulera LG ex vivo ger betydande fördelar för att studera dess utveckling. Detta inkluderar den hastighet med vilken forskaren har möjlighet att testa hypoteser och de många störningar som kan utföras för att bedöma hur epitelial, neuronal, endotelceller och mesencyhmal cellerna samverkar för att bilda organ. Det finns emellertid ett antal förbehåll när använder denna modell. Först på grund av sin isolering körteln inte längre är ansluten till den perifera kärlsy…

Materials

Name	Catalog #.	Company	Comments/Description
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1X PBS
Phosphate Buffered Saline 10X	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1X			Prepared from 10X stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.
BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
			Ideal for harvesting glands from embryos
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.