키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법
Summary
키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
만성 골수성 백혈병 (CML)의 구동 암에서 BCR / ABL의 발견 사실 효과적으로 CML 환자의 치료에 의해 암에서 키나제를 표적의 가능성을 보여, 글리벡의 개발 결과. 이러한 결과는 EGFR, B-RAF, KIT 및 PDGFRs 같은 다양한 다른 악성 종양에 연루 종양 키나제를 표적으로하는 약물 개발에 혁명을. 그러나, 항 – 키나아제 요법 하나의 주요 단점은 타겟 렌더링 약제 내성 돌연변이의 출현을 감소 또는 약물에 대한 친 화성을 잃어버린 것이다. 차세대 억제제를 개발하는 데 도움이뿐만 아니라 개인화 된 약을 사용 임상 관리에 자극을 제공뿐만 아니라 내성 변종에 의해 사용되는 메커니즘을 이해. 우리는 차세대 BCR / ABL 억제제 개발 도왔다 BCR / ABL에 저항을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 확인하는 레트로 바이러스 벡터 기반 스크리닝 전략을보고했다. Ruxoli 사용약물 표적 쌍으로 tinib과 JAK2, 우리가 JAK2 키나제의 무작위 돌연변이 라이브러리를 발현하는 마우스 BAF3 세포를 이용하여 체외 검사 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
단백질 키나제 겉보기 모든 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로의 중요한 조절 효소이다. 키나제 매개 신호의 적절한 제어는 대부분 UPS에 의해 인산화 효소, 포스 및 성능 저하의 적절한 규제 (유비퀴틴 프로 테아 좀 시스템)에 의존 항상성 및 개발에 매우 중요하다. 탈 조절 키나아제는 다양한 암의 중심 단계에있는 인간 숙주 질환 (1)의 연루. 인간 게놈은 직접 또는 간접적으로 결합 된 500 개 이상의 단백질 키나제, ~ 400에 인간이 질병을 인코딩한다. 이러한 관찰은 작은 분자 억제제 3-5로 키나아제의 치료 표적에 대한 개념을 지원했다.
만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 이러한 글리벡과 같은 ABL 키나제 억제제의 데모는,이 방법 6,7에 대한 개념의 증거를 제공했다. 이러한 관찰뿐만 아니라 개미 혁명I-키나제 치료하지만 또한 골수 증식 성 신 생물 (MPN)과 진성 적혈구 베라 (PV) 환자에서 JAK2에서 발암 돌연변이의 발견으로 이어질 치료 타겟팅 다른 양성 질환의 유전 적 병변을 확인하기 위해 아이디어를 적용. 이 발견은 작은 분자 키나제 억제제 JAK2을 대상으로 MPNs 치료에 큰 관심을 생성합니다. 이제, JAK2 억제제 십여 임상 시험에 있고 그 중 하나는 골수 섬유증의 치료를 위해 최근에 승인되었다. 암의 작은 분자 억제제에 의한 발암 키나제의 표적화는 유망한 결과를 가지고 있지만, 또한 치료에 대한 내성을 발전에서 겪고있다. 사실, 지금까지, 환자는 대부분 약물 8-10을 대상으로 할 키나제 도메인에 돌연변이를 획득함으로써 이러한 글리벡, 게 피티 니브, 플라세보과 스 프라이 셀과 같은 키나제 억제제와 저항 돌연변이를 개발 한 처리. 유전자 돌연변이의 결과로서 저항 O 제한 강조F는 종양 키나제에 대한 단독 요법을 목표로하고, 더욱 성공적인 암 화학 요법의 개발에 다음 도전을 나타냅니다. 약물 내성의 기계적 및 기능적 결과는 선택과 약물 개발을위한 무료 화합물의 설계를위한 이론적 근거를 제공해야한다. 시험 관내 스크린을 통해 확인 된 돌연변이는 환자에서 발견되는 것들과 높은 상관 관계를 보여 주었다. 따라서, 임상 재발을 일으킬 가능성이 저항 패턴을 식별 전임상 또는 임상 개발 어시스트 주어진 약물 표적 쌍에 대한 약물 내성을 부여 돌연변이 시험 관내 스크리닝. 이러한 돌연변이 형태의 식별뿐만 아니라 약물 반응과 재발하지만보다 강력한 차세대 억제제의 설계를위한 필수적의 환자 모니터링에 도움이됩니다. 예, 다음 세대 BCR / ABL 억제제, 닐 로티 닙과 Ponatinib의 개발을위한 때문에 더 멕의 가능하게되었다hanistic 이해는 돌연변이 유발, 구조 및 기능 연구로부터 얻었다.
앞서 우리는 글리벡 11, 12, PD166326 (12), 및 AP24163 (13) 억제제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 공개 BCR / ABL의 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 우리의 화면의 결과를보고했다. 결과뿐만 저항 및 임상 질환 재발을 부여하는 돌연변이를 식별 할뿐만 아니라 약제 내성 및 키나제 기능을 관장 11,14 원리 기전 이해를 제공 하였다. 여기에서 우리는이 심사 전략의 광범위한 응용 프로그램을 사용하려면, 약물 표적 쌍으로 Ruxolitinib과 JAK2를 사용하여, 추가 방법 론적 세부 사항을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
임상 적 재발과 표적 유전자의 약제 내성 돌연변이의 출현 : CML 치료에 글리벡의 임상 성공은 작은 분자 억제제에 의해 루즈 키나제를 표적으로의 가능성 만 대상으로 치료도 발견 제한뿐만 아니라 보여 주었다. 저항 돌연변이의 식별 더 나은 임상 관리 및 차세대 억제제의 개발에 도움이됩니다. 이 프로토콜은 표적 유전자에 약제 내성 돌연변이를 확인하는 방법을 설명한다. 이 방법은 E. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
References
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