Появление генетической устойчивостью против ингибитора киназы терапии представляет серьезную проблему для эффективной терапии рака. Определение и характеристика мутаций устойчивости против недавно разработанного препарата способствует лучшему клинического лечения и следующего поколения дизайна лекарств. Здесь мы описываем наш протокол для скрининга и подтверждения устойчивых мутаций в пробирке.
Открытие BCR / ABL как онкоген драйвера в хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) привело к разработке иматиниба, который, по сути, продемонстрировали потенциал ориентации киназы в раковых путем эффективного лечения больных ХМЛ. Это наблюдение революцию разработки лекарственных средств целевой онкогенных киназ, вовлеченных в различных других злокачественных опухолей, таких как, EGFR, B-RAF, KIT и PDGFRs. Тем не менее, один главный недостаток анти-киназы терапии является появление лекарственной устойчивости мутаций, оказывающих цель уменьшили или потеряли сродство к препарату. Понимание механизмов, занятых устойчивыми вариантов не только помогает в разработке ингибиторов нового поколения, но и дает толчок к клиническому ведению помощью персонализированной медицины. Мы сообщили ретровирусной стратегия скрининга для выявления спектра сопротивления, придающего мутации в BCR / ABL, который помог в разработке следующего поколения BCR / ABL ингибиторов. Использование Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевой препарат пары, здесь мы опишем в пробирке методов скрининга, который использует мышь BAF3 клетки, экспрессирующие случайные мутации библиотеку JAK2 киназы.
Протеинкиназы ключевых регуляторных ферментов внутриклеточных путей передачи сигналов, которые, казалось бы, модулируют каждый клеточной функции. Надлежащий контроль за киназный сигнализации имеет решающее значение для гомеостаза и развития, которые в основном опирается на надлежащее регулирование киназ, фосфатаз и его деградации по UPS (системы протеасома убикитина). Дерегулированных киназы находятся в центре внимания многих видов рака и участвуют в принимающих заболеваний человека 1. Геном человека кодирует более чем 500 протеинкиназы, которые были связаны, прямо или косвенно, ~ 400 заболеваний человека 2. Эти наблюдения поддерживают концепцию терапевтического нацеливания киназ по низкомолекулярные ингибиторы 3-5.
Демонстрация ABL ингибиторов киназы, такие как иматиниба, в лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) при условии, что доказательство концепции для этого подхода 6,7. Это наблюдение не только революцию в муравьяя-киназы терапия, но и в жизнь идею, чтобы определить генетические повреждения в других опухолевых заболеваний для терапевтического нацеливания, которые приводят к открытию онкогенных мутаций в JAK2 от истинной полицитемии (PV) и у пациентов с миелопролиферативных опухолей (MPN). Это открытие вызвало большой интерес в лечении MPNs путем охвата JAK2 с низкомолекулярных ингибиторов киназ. Теперь, почти десяток ингибиторов JAK2 в клинических испытаниях, и один из них был утвержден в последнее время для лечения миелофиброзом. В то время как специфическое нацеливание онкогенных киназ путем низкомолекулярные ингибиторы в раковых привести перспективный результат, он также страдает от развития резистентности к лечению. В самом деле, до сих пор, у пациентов, получавших ингибиторы киназы, такие как иматиниба, Gefitinib, Erlotinib и Dasatinib разработанные мутаций устойчивости в основном за счет приобретения мутаций в домене киназы, в которой лекарственных препаратов 8-10. Сопротивление в результате мутации гена подчеркивает ограничения уплотнительныеF направлена против монотерапии онкогенных киназ, и представляет собой следующий вызов в развитии все более успешной химиотерапии рака. Механистические и функциональные последствия лекарственной устойчивости должны обеспечить обоснование для выбора и проектирования бесплатные соединений для разработки лекарственных препаратов. Мутации, идентифицированные с помощью экранов в пробирке, показали высокую степень корреляции с тем, у больных. Таким образом, скрининг в пробирке для мутаций, которые придают лекарственную устойчивость для данного препарата целевых пар в клинических или доклинических способствует развитию в определении моделей устойчивости, которые могут привести к клинической рецидив. Идентификация этих мутантных форм не только полезно для мониторинга пациентов для ответа наркотиков и рецидивов, но также имеет важное значение для разработки более надежных ингибиторов следующего поколения. Например, развитие следующего поколения ингибиторов BCR / ABL, Nilotinib и Ponatinib, стало возможным из-за большей тесhanistic понимание получил от мутагенеза, структурных и функциональных исследований.
Ранее мы уже сообщали результаты нашего экрана с помощью случайного мутагенеза в BCR / ABL, чтобы выявить спектр мутаций, придающих устойчивость к ингибиторам, таких как иматиниба 11,12, PD166326 12, и AP24163 13. Результаты не только определили мутации, придающие клинической резистентности и болезни рецидив, но и при условии, что механическое понимание лекарственной устойчивости и принципов, регулирующих функцию киназы 11,14. Здесь мы предлагаем дополнительную методическую деталь, с помощью Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевого пары наркотиков, с тем чтобы более широкое применение этой стратегии скрининга.
Клинический успех иматиниба в лечении ХМЛ продемонстрировали не только потенциал таргетинга румяна киназы по низкомолекулярные ингибиторы, но и раскрыли ограничения таргетной терапии: клиническое рецидива и появления мутаций лекарственной устойчивости в гене-мишени. Идентификация…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
Cell and Tissue culture | |||
BaF3 Cells | ATCC | ||
HEK293T cells | ATCC | ||
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
FBS | Atlanta biological | S11150 | |
Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
WST-1 | Roche | 11644807001 | |
0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
Bacterial Culture | |||
XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
SOC | New England Biolabs | B90920s | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
Bacto agar | Difco | 214050 | |
Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
Kits | |||
Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
Mouse reagents | |||
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
Instruments | |||
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |