Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem
Summary
Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.
Abstract
Kronik miyeloid lösemi (KML) bir sürücü onkogen olarak BCR / ABL keşif aslında, etkin bir KML hastaları tedavi ile kanserlerde kinaz hedefleyen potansiyelini gösterdi, Imatinib, geliştirme sonuçlandı. Bu gözlem gibi EGFR, B-RAF, KIT ve PDGFRs, gibi çeşitli diğer maligniteler, karıştığı onkojenik kinazlar hedef ilaç geliştirme devrim. Ancak, anti-kinaz tedavilerin bir büyük dezavantajı hedef render ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması azalır veya ilaç için afinite kaybetmiş olmaktır. Gelecek nesil inhibitörleri gelişmekte yardımcı olur, aynı zamanda kişiselleştirilmiş ilaç kullanarak klinik yönetimi ivme verir sadece dirençli varyantları tarafından istihdam mekanizmaların anlaşılması. Biz yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri gelişmekte yardımcı oldu BCR / ABL, mutasyonlar veren direnç spektrumunu belirlemek için bir retroviral vektör tabanlı tarama stratejisi bildirdi. Ruxoli kullanılmasıBir ilaç hedef çifti olarak tinib ve JAK2, burada JAK2 kinaz rastgele mutasyon kütüphane ifade fare BAF3 hücrelerini kullanan in vitro tarama yöntemleri açıklar.
Introduction
Protein kinazlar, görünüşte her hücre fonksiyonunu modüle eden hücre içi sinyal iletim yollarında önemli bir düzenleyici enzimdir. Kinaz aracılı sinyalizasyon düzgün bir denetim çoğunlukla UPS tarafından kinazlar, fosfatazların ve bozulması uygun yönetmelik (Ubikutin proteazom sistemi) dayanır homeostaz ve gelişim için çok önemlidir. Kuralsız kinazlar birçok kanser merkezi aşamasında olan ve insan hastalıklarının 1 ev sahibi sorumlu. İnsan genomu ile doğrudan ya da dolaylı olarak bağlantılı olmuştur 500'den protein kinazları için ~ 400 insan hastalıkları 2 kodlar. Bu gözlemler, küçük molekül inhibitörleri 3-5 kinaz terapötik hedefleme için düşüncesini desteklemiştir.
Kronik miyeloid lösemi (KML) tedavisinde gibi Imatinib gibi ABL kinaz inhibitörlerinin, gösteri, bu yaklaşımın 6,7 konseptinin kanıtı sağlanmıştır. Bu gözlem sadece karınca devrimi-kinaz tedavi değil, aynı zamanda Miyeloproliferatif neoplazmlar (EMS) ile polisitemi vera (PV) ve hastaların JAK2'nın onkojenik mutasyonlar keşfine yol terapötik hedefleme için diğer neoplastik hastalıklar, genetik lezyonların tespit etmek fikri zorlanan. Bu keşif, küçük molekül kinaz inhibitörleri ile JAK2 hedefleyerek MPNs tedavisinde büyük ilgi gördü. Şimdi, JAK2 inhibitörlerinin neredeyse bir düzine klinik çalışmalarda ve bunlardan bir tanesi myelofibrozis tedavisi için son onaylanmıştır. Kanserlerde küçük molekül inhibitörleri tarafından onkojenik kinaz spesifik hedefleme umut verici sonuçlar getirmek, aynı zamanda tedaviye direnç gelişmekte muzdarip. Aslında, bugüne kadar, hastalar çoğunlukla ilaç 8-10 hedefler için hangi kinaz etki mutasyonlar alarak böyle İmatinib, Gefitinib, Erlotinib ve Dasatinib gibi kinaz inhibitörleri, direnç mutasyonları geliştirdi tedavi. Gen mutasyonu sonucu direnç o sınırlamaları vurgulamaktadırf onkojenik kinazlara karşı monoterapi hedefli ve her zamankinden daha başarılı kanser kemoterapisi gelişiminde bir sonraki meydan temsil eder. Ilaç direncinin mekanik ve fonksiyonel sonuçları seçimi ve ilaç geliştirme için ücretsiz bileşiklerin tasarımı için bir gerekçe sunmalıdır. In vitro ekranlar ile tanımlanan mutasyonlar, hastalarda bulunanlar ile korelasyon yüksek derecede göstermiştir. Bu nedenle, klinik nüks neden muhtemeldir direnç kalıplarını belirlemede klinik veya preklinik kalkınma asist belirli bir ilaç hedef çiftleri için ilaç direnç kazandıran mutasyonlar in vitro tarama. Bu mutant formlarının tanımlanması sadece ilaç tepkisi ve nüksetme ama daha güçlü yeni nesil inhibitörlerinin tasarımı için de gereklidir için hastaların izlenmesinde yararlı olacaktır. Örneğin, yeni nesil BCR / ABL inhibitörleri, nilotinib ve Ponatinib gelişmesi için, çünkü daha mec mümkün olmuşturhanistic anlayış mutagenez, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar elde.
Daha önce, biz böyle Imatinib 11,12, PD166326 12, ve AP24163 13 gibi inhibitörleri direnç kazandıran mutasyonlar spektrumunu ortaya çıkarmak için BCR / ABL rastgele mutajenezini kullanarak ekranın sonuçlarını bildirmişlerdir. Sonuçlar sadece klinik direnç ve hastalık nüksü veren mutasyonları tespit değil, aynı zamanda ilaç direnci ve kinaz fonksiyonunu 11,14 yöneten ilkeler mekanik anlayış sağladı. İşte bu tarama stratejisinin daha geniş bir uygulama sağlamak için, bir ilaç hedef çifti olarak Ruxolitinib ve JAK2 kullanarak, ek metodolojik ayrıntı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klinik nüks ve hedef gen ilaç direnci mutasyonlarının ortaya çıkması: KML tedavisinde Imatinib klinik başarısı küçük molekül inhibitörleri ile rouge kinazlar hedef potansiyelini, ancak hedeflenen tedavinin de ortaya sınırlamaları sadece gösterdi. Direnç mutasyonlarının tanımlanması daha iyi klinik yönetimi ve gelecek nesil inhibitörlerinin gelişimine yardımcı olur. Bu protokol, hedeflenmiş genin ilaca dirençli mutasyonları tespit etmek için bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem E….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
References
- Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
- Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases–the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
