تقنيات التجريبية والتصوير لدراسة الهياكل الليفين الجلطة في السليمة والمصابة الولايات
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
يتم إصلاح إصابة البطانية بطانة الأوعية الدموية من خلال الاستجابة مرقئ، أو تشكيل لتجلط الدم. عندما يتخلل الدم في المصفوفة خارج الخلية، والعوامل الأنسجة تنشيط الصفائح الدموية في مجرى الدم التي تسهل الشروع في شلال التخثر. المكون الميكانيكي الرئيسي من هذه العملية هو شفاء المصفوفة الليفين، وتتألف من ألياف الفيبرين التي هي مرنة للغاية، ويمكن الحفاظ قوات كبيرة 1-4. لقد درس كثير من الباحثين بنية تشكيل وظيفة الفيبرين على نطاق واسع في العقود الماضية 5-13.
المرضى الذين يعانون من أمراض مثل داء السكري وفقر الدم المنجلي لديهم خطر متزايد لتطوير مضاعفات الجلطات مثل احتشاء عضلة القلب وأمراض نقص تروية القلب، والسكتات الدماغية 14-19. يتم تشخيص أكثر من 2 مليون شخص حديثا مع داء السكري كل عام في الولايات المتحدة. هناك نوعان من مرض السكري: النوع الأول، حيثفشل الجسم على إنتاج كميات كافية من الأنسولين، والنوع الثاني، حيث يصبح الجسم مقاوما للأنسولين. بين مرضى السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب ل80٪ من المراضة والوفيات المرتبطة بهذا المرض 20،21.
مرض فقر الدم المنجلي (SCD) هو اضطراب وراثي في الدم يؤثر على أكثر من 100،000 شخص في الولايات المتحدة (22). SCD هو مرض نقاط الطفرة التي تسبب خلايا الدم الحمراء لتصبح على شكل هلال، مما يجعل من الصعب على الخلايا لتمر عبر الأوعية الدموية في الدم 23. كل من هذه الحالات المرضية تزيد من فرص تطوير الظروف atherothrombotic في الجسم. واحدة من أسباب ذلك هو نتيجة لهيكل الفيبرين تغيير وظيفة في الدول المريضة 14،24-26.
في كل من السكري ومرض فقر الدم المنجلي، وهناك hypercoagulation والنشاط hypofibrinolysis أن يدفع atherothrombosis وأمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) بالمقارنة مع المرضى الأصحاء 17،27،28. ومن المعروف أن hypofibrinolysis يشجع تصلب الشرايين التقدم ويولد الأحداث الدماغية المتكررة للمرضى الذين يعانون من السابق لأوانه مرض الشريان التاجي (29). في المخطوطة الحالية، ونحن التحقيق في دور الخصائص الفيزيائية الليفين في هذا الإعداد معين. وتتكون الهياكل جلطة الفيبرين في المرضى غير المريضة من ألياف رقيقة، والمسام الكبيرة، وعموما أقل كثافة 14،24. تم العثور على زيادة المسامية وجلطات الفيبرين أقل كثافة في المرضى الأصحاء لتسهيل انحلال الفيبرين 16. في ظروف hyperthrombotic مثل مرض الخلية المنجلية ومرض السكري، وهناك زيادة في الإنتاج الفيبرينوجين، مما تسبب في تركيز الفيبرينوجين إلى زيادة من المستويات العادية من 2.5 ملغ / مل في المرضى الأصحاء 30-33. تم العثور على تجلط الليفين التي تشكلت في مرضى السكري إلى أن تكون أقل مسامية، أكثر جمودا، على المزيد من النقاط فرع، وأكثر كثافة بالمقارنة مع الأصحاء، وعدم ديا-المرضى betic 14،24،33-35. هيكل الفيبرين تغيير هو نتيجة لآليات غلكأيشن التي تحدث في البروتينات المشاركة في تشكيل الجلطة. يحدث غير إنزيمي (لا رجعة فيه) غلكأيشن عندما ربط جزيئات الجلوكوز إلى بقايا يسين على جزيء الفيبرينوجين، الذي يثبط عامل XIIIa البشري (FXIIIa) من الجلوتامين ويسين المخلفات بشكل صحيح عبر ربط 33،36،37.
وقد تمت دراسة التحليل الهيكلي للشبكات الفيبرين على نطاق واسع في الآونة الأخيرة. على وجه الخصوص، واستخدمت الباحثين المجهر الإلكتروني وإعادة الإعمار 3D شبكات الفيبرين 38، التحقيق في الكيفية التي تؤثر بها على حد سواء داخل الأوعية الدموية (البطانية) الخلايا وخارج الأوعية (الخلايا الليفية والعضلات الملساء) خلايا هيكل الفيبرين 39، اللزجة المستخدمة والتحليل الطيفي لتحليل الهياكل الفيبرين 40، و الارتباطات المتقدمة بين هيكل الفيبرين والخواص الميكانيكية باستخدام التجريبية والنهج الحاسوبية 41 </sup>. وكان التركيز في الدراسة الحالية لصياغة هياكل جلطة في ظل ظروف السكري والجلطة خلية المنجل محاكاة واستخدام متحد البؤر المجهري لفحص بنية ووظيفة جلطات في الدول المريضة. وتم تشكيل جلطات الليفين من الفيبرينوجين البشري، الثرومبين البشري، وFXIIIa. وهي lysed الجلطات باستخدام بلازمين. لمحاكاة الظروف السكري، وقد حضنت زيادة تركيز الفيبرينوجين في حل الجلوكوز للحث في المختبر الفيبرينوجين غلكأيشن. لمحاكاة الظروف تخثر مرض الخلية المنجلية، كانت مختلطة زيادة تركيز الفيبرينوجين مع الهيماتوكريت المنجلي تم جمعها من المرضى كما فعلت سابقا من قبل لدينا مجموعة 42. وقد استخدمت هذه الأساليب لدراسة هيكل ووظائف المشاركة في تشكيل جلطة الفيبرين وانحلال الفيبرين في ظل ظروف المريضة، فضلا عن الآليات التي تحفز الأمراض القلبية الوعائية. وبناء على المعلومات الحالية حول هذه الأمراض، كانت الهياكل الفيبرين جلطة السكري أكثر كثافة مع عدد أقل منالثانية المسام أصغر. وكانت جلطات الفيبرين مع خلايا الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي (كرات الدم الحمراء) أيضا أكثر كثافة وعرضها التجميع من كرات الدم الحمراء ومجموعات الفيبرين مكتل. وهذه ظاهرة راسخة الذي تم تحديده سابقا 43. وقد افترض أيضا أن معدل انحلال الفيبرين سيكون أقل من ذلك بكثير في تجلط الليفين السكري مع وبدون تخفيض بلازمين مقارنة صحي، الفيبرين العادي. وأظهرت النتائج أن للجلطات الفيبرين السكري، ولوحظت نتائج معدل تحلل مختلفة إلى حد كبير إلا في ظل ظروف انخفاض تركيز بلازمين. هذه التقنية التجريبية من استخدام متحد البؤر المجهري تقدم مزايا هامة على طرق التصوير الأخرى لأن الخلايا والبروتينات لا تزال في دولتهم الأم، والتي تمكن من التقاط الفيديو في الوقت الحقيقي لنشاط التخثر. هذا الأسلوب من تخثر حمل صناعي هو أيضا أرخص وأكثر كفاءة من الوقت الحصول على عينات من المرضى وتصفية فردالبروتينات والانزيمات. وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام البروتينات والانزيمات فصل لتجميع الجلطات، وموحدة للجلطات بحيث لم يكن هناك التباين بين العينات نتيجة لبروتينات أخرى في البلازما.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على بيانات ذات مغزى حول بنية آليات التخثر في الحالات المرضية، من المهم لعزل العوامل التي تدخل في تخثر لتحديد الآثار المترتبة على البروتينات والخلايا في هذه الظروف. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأغراض التحقيق في هيكل جلطة الفيبرين في الدول السكري وSCD في المخت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. . Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).
- Lindman, H. R. . Analysis of variance in experimental designs. , (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).
