Экспериментальные и визуализации Методы для изучения сгустка фибрина структур в норме и болезненные состояния,
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
Повреждение эндотелия накладки кровеносных сосудов является исправлено с помощью гемостаза ответ, или образования сгустка крови. Когда кровь проникает во внеклеточный матрикс, факторы ткани активации тромбоцитов в крови, которые способствуют инициации каскада свертывания. Ключ механический компонент этого процесса исцеления фибрина матрица, состоящая из фибрина волокон, которые являются весьма эластичен, и может выдержать большие силы 1-4. Многие исследователи изучали структуру формирования и функции фибрина широко в последние десятилетия 5-13.
Пациенты с такими заболеваниями, как сахарный диабет и серповидно-клеточная имеют повышенный риск развития тромботических осложнений, таких как инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, и гладит 14-19. Более 2 миллионов человек только что поставили диагноз сахарный диабет каждый год в Соединенных Штатах. Есть два типа сахарного диабета: тип I, гдеорганизм не может производить достаточное количество инсулина, и типа II, где тело становится резистентным к инсулину. Среди больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются причиной 80% заболеваемости и смертности, связанной с заболеванием 20,21.
Серп клеточная болезнь (SCD) является генетическое заболевание крови, что влияет на более чем 100000 человек в Соединенных Штатах 22. ВСС является заболеванием, точка-мутации, что вызывает красные кровяные клетки, чтобы стать в форме полумесяца, что затрудняет клетки проходить через сосудистую крови 23. Оба этих болезненных состояний увеличить шансы развития атеротромбоза условия в организме. Одной из причин этого является то, результат измененной структурой фибрина и функции в болезненные состояния, 14,24-26.
В обоих диабетом и серповидно-клеточной анемией, есть гиперкоагуляция и hypofibrinolysis деятельность, которая вызывает атеротромбоза и сердечно-сосудистых заболеваний (CВ.Д.) по сравнению со здоровыми пациентами 17,27,28. Известно, что hypofibrinolysis способствует развитию атеросклероза и порождает повторных ишемических событий для пациентов с преждевременной ишемической болезни сердца 29. В текущем рукописи, мы исследовали роль фибрина физических свойств в данном обстановке. Сгусток фибрина структуры в не-больных пациентов состоят из тонких волокон, крупных пор и в целом менее плотной 14,24. Увеличение пористости и менее плотные сгустки фибрина у здоровых пациентов были обнаружены чтобы облегчить фибринолиз 16. В hyperthrombotic условий, таких как диабетическая и серповидно-клеточной анемии, происходит увеличение производства фибриногена, в результате чего концентрация фибриногена, чтобы увеличить от нормальных уровней 2,5 мг / мл у здоровых пациентов 30-33. Сгустков фибрина, образованные у больных сахарным диабетом были найдены, чтобы быть менее пористым, более жесткой, больше точки ветвления, и плотнее, по сравнению с здоровых, не диаметромBetic пациентов 14,24,33-35. Изменена структура фибрина является результатом гликирования механизмов, которые происходят в белках, участвующих в тромба. Неэнзиматической (необратимое) гликирование происходит, когда молекулы глюкозы связываются с остатками лизина в молекуле фибриногена, который ингибирует человеческий фактор XIIIa (FXIIIa) от правильно сшивающих глютамина и лизина 33,36,37.
Структурный анализ фибрина сетей была изучена в последнее время. В частности, исследователи использовали электронную микроскопию и 3D-реконструкция фибрина сетей 38, исследованных как оба внутрисосудистых (эндотелиальные) клетки и внесосудистые (фибробласты и гладкие мышцы) клетки влияют фибрина структуру 39, используемых вязкоупругих и спектральный анализ анализировать фибрина структуры 40, и развитые корреляции между структурой фибрина и механических свойств с помощью экспериментальных и расчетных подходов 41 </sup>. В центре внимания данного исследования заключалась в разработке сгусток структуры моделируемых условиях диабетической и молот тромбоза клеток и использовать конфокальной микроскопии для исследования структуры и функции тромбов в болезненные состояния. Сгустки фибрина были сформированы из фибриногена человека, тромбина человека и FXIIIa. Сгустки лизируют с помощью плазмина. Для моделирования диабетических условий, повышение концентрации фибриногена инкубировали в растворе глюкозы, чтобы вызвать в пробирке фибриногена гликирование. Для имитации серповидно-клеточной анемией условия свертывания, повышение концентрации фибриногена смешивают с серповидно-клеточной гематокрита, полученной от больных, как это сделано ранее в нашей группе 42. Эти методы были использованы для изучения структуры и функций, участвующих в образовании сгустка фибрина и фибринолиза при болезненных состояниях, а также механизмы, которые вызывают ССЗ. На основании текущей информации об этих заболеваний, гликозилированного фибринового сгустка структуры были плотнее с меньшим Аой мелкие поры. Фибрина сгустки с красных кровяных клеток из серпа больных клеток (эритроцитов) также плотнее и отображается агрегацию эритроцитов и агломерированные фибрина кластеров. Это хорошо установлено, что явление было определено ранее 43. Было также высказано предположение, что скорость фибринолиза будет значительно ниже в гликированного сгустков фибрина с и без плазмина пониженном по сравнению со здоровыми, нормального фибрина. Результаты показали, что для гликированного сгустков фибрина, значительно отличающиеся результаты скорости лизиса были обнаружены только в условиях пониженной концентрации плазмина. Этот экспериментальный методика с использованием конфокальной микроскопии обеспечивает значительные преимущества по сравнению с другими методами обработки изображений, потому что клетки и белки остаются в их нативном состоянии, что позволяет захват видео в реальном времени от активность по свертыванию. Этот метод синтетически, индуцирующих свертывание и дешевле, и больше времени эффективным, чем получение образцов пациентов и фильтрации человекабелков и ферментов. Кроме того, с помощью разделенных белков и ферментов для синтеза сгустки, тромбы были стандартизированы так, чтобы не было вариабельность между образцами, в результате других белков в плазме.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы получить значимые данные о структуре свертывания механизмов болезненных состояний, важно, чтобы изолировать факторы, участвующие в процессе свертывания, чтобы определить эффекты белков и клеток в этих условиях. Этот протокол был разработан в целях изучения структуры фибриново?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. . Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).
- Lindman, H. R. . Analysis of variance in experimental designs. , (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).
