Eksperimentelle og billedteknikker for behandlingen fibrinkoagel Structures i Normal og sygdomstilstande

Summary

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Abstract

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Introduction

Skade på et blodkar er endothelbeklædning repareres gennem den hæmostatiske respons, eller dannelse af en blodprop. Når blodet trænger ind den ekstracellulære matrix aktiverer vævsfaktorer blodplader i blodet, som letter indledningen af ​​koagulationskaskaden. Nøglen mekaniske del af denne helingsproces er fibrinmatrixen sammensat af fibrin fibre, der er meget elastisk og kan opretholde store kræfter ^1-4. Mange forskere har undersøgt dannelsen struktur og funktion af fibrin i udstrakt grad i de seneste årtier ^5-13.

Patienter med sygdomme, såsom diabetes mellitus og seglcelle har en øget risiko for at udvikle thrombotiske komplikationer såsom myokardieinfarkter, iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde ^14-19. Over 2 millioner mennesker er nyligt diagnosticeret med diabetes mellitus hvert år i USA. Der er to typer af diabetes: Type I, hvorkrop ikke producerer tilstrækkelige mængder af insulin, og type II, hvor kroppen bliver resistent over for insulin. Blandt diabetespatienter, hjerte-kar-sygdom (CVD) er årsag til 80% af sygelighed og dødelighed forbundet med sygdommen ^20,21.

Seglcelle sygdom (SCD) er en genetisk blodsygdom, der påvirker mere end 100.000 mennesker i USA ^22. SCD er et punkt-mutation sygdom, der forårsager røde blodlegemer at blive halvmåne-formet, hvilket gør det vanskeligt for celler at passere gennem blod vaskulatur ^23. Begge disse sygdomstilstande øge chancerne for at udvikle aterotrombotiske betingelser i kroppen. En af grundene til dette er et resultat af ændret fibrin struktur og funktion i sygdomstilstande ^14,24-26.

I både diabetes og seglcelleanæmi, er der hyperkoagulation og hypofibrinolysis aktivitet, der inducerer aterotrombose og hjerte-kar-sygdom (CVD) sammenlignet med raske patienter ^17,27,28. Det er kendt, at hypofibrinolysis fremmer åreforkalkning progression og skaber tilbagevendende iskæmiske hændelser hos patienter med tidlig koronararteriesygdom ^29. I den nuværende manuskript, undersøgte vi rollen af ​​fibrin fysiske egenskaber i denne indstilling. Fibrinkoagel strukturer i ikke-syge patienter er sammensat af tynde fibre, større porer, og generelt mindre tætte ^14,24. Den øgede porøsitet og mindre tætte fibrinklumper i raske patienter har vist sig at lette fibrinolyse ^16. I hyperthrombotic tilstande, såsom diabetisk og seglcelleanæmi, er der en stigning i fibrinogen produktion, forårsager fibrinogenkoncentration at stige fra normale niveauer på 2,5 mg / ml i raske patienter ^30-33. Fibrinkoagulater dannet i diabetiske patienter har vist sig at være mindre porøse, mere stiv, har flere forgreningspunkter, og tættere i forhold til sunde, ikke-diaBetic patienter ^14,24,33-35. Den ændrede fibrin struktur er et resultat af glycosyleringsassays mekanismer, der forekommer i de involverede i koageldannelse proteiner. Ikke-enzymatisk (irreversibel) glykering opstår, når glukose molekyler binder til lysinrester på fibrinogen molekyle, som hæmmer menneskelige faktor Xllla (FXIIIa) fra korrekt cross-linking glutamin og lysinrester ^33,36,37.

Den strukturelle analyse af fibrin-net er blevet undersøgt i udstrakt grad for nylig. Især har forskere udnyttet elektronmikroskopi og 3D rekonstruktion af fibrin-net ^38, undersøgte hvordan både intravaskulære (endotelceller) celler og ekstravaskulære (fibroblaster og glatte muskelceller) celler påvirker fibrin struktur ^39, anvendt viskoelastiske og spektral analyse til at analysere fibrin strukturer ^40, og udviklede korrelationer mellem fibrin struktur og mekaniske egenskaber ved hjælp af eksperimentelle og beregningsmæssige metoder ⁴¹ </sup>. Fokus for den aktuelle undersøgelse var at formulere blodprop strukturer under simulerede diabetiker og seglcelle trombose forhold og anvende konfokal mikroskopi til undersøgelse af struktur og funktion af blodpropper i sygdomstilstande. Fibrinkoagulater blev dannet fra human fibrinogen, humant thrombin, og FXIIIa. De blodpropper blev lyseret ved hjælp af plasmin. For at simulere diabetiske betingelser blev forøget koncentration af fibrinogen inkuberet i glucoseopløsning til at inducere in vitro fibrinogen glycosylering. For at simulere Seglcellesygdom størkning betingelser ledsagedes øgede fibrinogenkoncentrationer blandet med seglcelle hæmatokrit indsamlet fra patienter som udført tidligere af vores gruppe ^42. Disse metoder blev anvendt til at undersøge struktur og funktioner, der er involveret i fibrinklumpdannelse og fibrinolyse under sygdomstilstande samt de mekanismer, der inducerer CVD. Baseret på aktuelle oplysninger om disse sygdomme, de glycerede fibrinkoagel strukturer var tættere med færre and mindre porer. De fibrinkoagulater med røde blodlegemer fra seglcellepatienter (RBC) var også tættere og vises aggregering af de røde blodlegemer og agglomereret fibrin klynger. Dette er et veletableret fænomen der er blevet bestemt tidligere ^43. Det blev også en hypotese, at den fibrinolyse sats ville være betydeligt lavere i glycerede fibrinklumper med og uden nedsat plasmin sammenlignet med raske, normale fibrin. Resultaterne viste, at af glykosyleret fibrinklumper, var signifikant forskellige lysis prisresultaterne kun observeret under betingelser med reduceret plasmin koncentration. Denne eksperimentelle teknik med at bruge konfokal mikroskopi giver betydelige fordele i forhold til andre billeddiagnostiske metoder, fordi cellerne og proteiner forbliver i deres oprindelige tilstand, som gør det muligt registrering af real-time video af koagulation aktivitet. Denne metode til syntetisk inducerende størkning er også billigere og mere tid effektivt end at få patientprøver og bortfiltrere individuelproteiner og enzymer. Endvidere, ved anvendelse af separerede proteiner og enzymer til at syntetisere blodpropper blev blodpropper standardiseret, således at der ikke var variabilitet mellem prøver som følge af andre proteiner i plasma.

Protocol

BEMÆRK: Følgende protokol følger retningslinjerne fastsat af Institutional Review Board (IRB) ved Georgia Tech. 1. Blodprøvetagning og røde blodlegemer isoleringsprocedure Saml 40-120 ml blod fra donorer i 10 ml hepariniserede vakuumbeholderrør. Start PBMC (perifert blod mononukleære celler) isolation inden 4 timer efter prøvetagning. I løbet af denne tid, holde blod ved stuetemperatur. BEMÆRK: O / N opbevaring af blod i RT eller 4 ° C anbefales ikke,</st…

Representative Results

Konfokal mikroskopi Analyse af glykeret fibrinkoagel Structures De konfokal mikroskopi billeder af normale og glycerede blodpropper er præsenteret i figur 3. Konfokal mikroskopi-analyse af de normale og glycerede blodpropper afslører, at glycerede blodpropper er tættere med mindre porer end det normale blodpropper både med og uden tilsætning af FXIIIa under blodprop polymerisation. I figur 3A og 3B, er der en lavere fibrin koncentration…

Discussion

For at opnå meningsfulde data om strukturen af ​​clotting mekanismer sygdomstilstande, er det vigtigt at isolere de faktorer involveret i koagulation for at bestemme virkningerne af proteiner og celler i disse betingelser. Denne protokol blev udviklet med henblik på at undersøge strukturen af fibrinkoagel i diabetiske og SCD stater in vitro.

Det er nødvendigt at forstå de mekanismer involveret i fibrindannelse og fibrinolyse i sygdomstilstande siden ændrede betingelser giv…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 mL graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22