सामान्य और रोगग्रस्त राज्य अमेरिका में आतंच थक्का संरचनाएं की जांच के लिए प्रायोगिक और इमेजिंग तकनीक
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
एक रक्त वाहिका के endothelial अस्तर को चोट hemostatic प्रतिक्रिया, या खून का थक्का के गठन के माध्यम से मरम्मत की है। रक्त बाह्य मैट्रिक्स में व्याप्त है, जब ऊतक कारकों जमावट झरना की दीक्षा की सुविधा है कि रक्त प्रवाह में प्लेटलेट्स को सक्रिय करें। इस उपचार प्रक्रिया की कुंजी मैकेनिकल घटक अत्यधिक लोचदार हैं कि आतंच फाइबर से बना आतंच मैट्रिक्स, है, और बड़े बलों 1-4 बनाए रख सकते हैं। कई शोधकर्ताओं ने बड़े पैमाने पर पिछले दशकों 13/05 में आतंच के गठन की संरचना, और समारोह का अध्ययन किया है।
इस तरह के मधुमेह और सिकल सेल के रूप में बीमारियों के साथ रोगियों में इस तरह के दौरे infarctions, इस्कीमिक हृदय रोग के रूप में थ्रोम्बोटिक जटिलताओं के विकसित होने का खतरा बढ़ जाता है, और 14-19 स्ट्रोक। 2 लाख से अधिक लोगों को नव संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल मधुमेह के साथ का निदान कर रहे हैं। प्रकार मैं जहां,: मधुमेह के दो प्रकार के होते हैंशरीर शरीर में इंसुलिन के लिए प्रतिरोधी हो जाता है, जहां इंसुलिन, और प्रकार द्वितीय, की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन करने में विफल रहता है। मधुमेह के रोगियों के अलावा, हृदय रोग (सीवीडी) रोग 20,21 के साथ जुड़े रुग्णता और मृत्यु दर के 80% के लिए कारण है।
सिकल सेल रोग (एससीडी) संयुक्त राज्य अमेरिका के 22 में 100,000 से अधिक लोगों को प्रभावित करता है कि एक आनुवंशिक रक्त विकार है। एससीडी यह मुश्किल कोशिकाओं को रक्त वाहिका 23 के माध्यम से पारित करने के लिए कर रही है, चंद्राकार बनने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं का कारण बनता है कि एक बिंदु उत्परिवर्तन की बीमारी है। इन रोग राज्यों के दोनों के शरीर में atherothrombotic शर्तों के विकास की संभावना में वृद्धि। इस के लिए कारणों में से एक रोगग्रस्त राज्यों 14,24-26 में बदल आतंच संरचना और समारोह का परिणाम है।
दोनों मधुमेह और सिकल सेल रोग में, hypercoagulation और atherothrombosis और हृदय रोग लाती है कि hypofibrinolysis गतिविधि (सी नहीं हैवी डी) स्वस्थ रोगियों 17,27,28 की तुलना में। यह hypofibrinolysis atherosclerosis के प्रगति को बढ़ावा देता है और समय से पहले कोरोनरी धमनी की बीमारी 29 के रोगियों के लिए बारम्बार इस्कीमिक घटनाओं engenders कि जाना जाता है। वर्तमान पांडुलिपि में, हम यह विशेष रूप से स्थापित करने में आतंच भौतिक गुणों की भूमिका की जांच की। गैर रोगग्रस्त रोगियों में आतंच थक्का संरचनाओं पतली फाइबर, बड़ा है pores, और आम तौर पर कम घने 14,24 से बना रहे हैं। स्वस्थ रोगियों में वृद्धि की porosity और कम घने आतंच थक्के फाइब्रिनोलयन 16 की सुविधा के लिए पाया गया है। इस तरह के मधुमेह और सिकल सेल रोग के रूप में hyperthrombotic परिस्थितियों में, स्वस्थ रोगियों 30-33 में 2.5 मिलीग्राम / एमएल के सामान्य स्तर से बढ़ाने के लिए फाइब्रिनोजेन एकाग्रता के कारण फाइब्रिनोजेन उत्पादन में वृद्धि हुई है, वहाँ है। स्वस्थ, गैर व्यास की तुलना में जब मधुमेह के रोगियों में गठित आतंच थक्के अधिक शाखा अंक है, और सघन, अधिक कठोर, कम असुरक्षित होना पाया गया हैbetic रोगियों 14,24,33-35। बदल आतंच संरचना का थक्का गठन में शामिल प्रोटीन में पाए जाते हैं कि ग्लिकेशन तंत्र का परिणाम है। ग्लूकोज के अणुओं को ठीक से पार जोड़ने glutamine और लाइसिन अवशेषों 33,36,37 से मानवीय पहलू XIIIa (FXIIIa) को रोकता है जो फाइब्रिनोजेन अणु, पर लाइसिन अवशेषों के लिए बाध्य जब Nonenzymatic (अपरिवर्तनीय) ग्लिकेशन होता है।
आतंच नेटवर्क के संरचनात्मक विश्लेषण हाल ही में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से, शोधकर्ताओं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और intravascular (endothelial सेल) और extravascular (fibroblasts और चिकनी मांसपेशी) दोनों कोशिकाओं आतंच संरचनाओं 40 विश्लेषण करने के लिए आतंच संरचना 39, उपयोग किया viscoelastic और वर्णक्रम विश्लेषण कैसे प्रभावित जांच आतंच नेटवर्क 38, के 3 डी पुनर्निर्माण, और का उपयोग किया है आतंच संरचना और यांत्रिक गुणों के बीच विकसित सहसंबंध प्रयोगात्मक का उपयोग करने और कम्प्यूटेशनल 41 दृष्टिकोण </sup>। वर्तमान अध्ययन का ध्यान केंद्रित नकली मधुमेह और सिकल सेल घनास्त्रता की शर्तों के तहत थक्का संरचनाओं तैयार करने और रोगग्रस्त राज्यों में थक्के की संरचना की परीक्षा और समारोह के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए किया गया था। आतंच थक्के मानव फाइब्रिनोजेन, मानव थ्रोम्बिन, और FXIIIa से गठन किया गया। थक्के plasmin का उपयोग कर lysed रहे थे। मधुमेह शर्तें अनुकरण करने के लिए, फाइब्रिनोजेन की वृद्धि की एकाग्रता में इन विट्रो फाइब्रिनोजेन ग्लिकेशन प्रेरित करने के लिए ग्लूकोज समाधान में incubated किया गया था। सिकल सेल रोग के थक्के शर्तों अनुकरण करने के लिए, वृद्धि हुई फाइब्रिनोजेन सांद्रता हमारे समूह में 42 से पहले किया के रूप में रोगियों से एकत्र सिकल सेल हेमाटोक्रिट के साथ मिलाया गया। इन विधियों संरचना और रोगग्रस्त शर्तों के तहत आतंच थक्का बनने और फाइब्रिनोलयन में शामिल काम करता है, और साथ ही सीवीडी प्रेरित तंत्र है कि जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इन बीमारियों के बारे में वर्तमान जानकारी के आधार पर, Glycated आतंच थक्का संरचनाओं कम एक साथ सघन थेएन डी छोटे pores के। सिकल सेल रोगियों (लाल रक्त कोशिकाओं) से लाल रक्त कोशिकाओं के साथ आतंच थक्के भी सघन थे और लाल रक्त कोशिकाओं के एकत्रीकरण और Agglomerated आतंच समूहों का प्रदर्शन किया। यह पहले 43 निर्धारित किया गया है कि एक अच्छी तरह से स्थापित घटना है। यह भी फाइब्रिनोलयन दर के साथ और स्वस्थ, सामान्य आतंच की तुलना में कम plasmin बिना Glycated आतंच के थक्के में काफी कम होगा धारणा है कि गया था। परिणाम Glycated आतंच के थक्के के लिए, काफी अलग सेल दर परिणाम केवल कम plasmin एकाग्रता की शर्तों के तहत मनाया गया है कि पता चला है। कोशिकाओं और प्रोटीन के थक्के गतिविधि का वास्तविक समय वीडियो का कब्जा सक्षम बनाता है जो उनके मूल राज्य में रहते हैं क्योंकि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का यह प्रयोगात्मक तकनीक अन्य तरीकों इमेजिंग अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। Synthetically का उत्प्रेरण के थक्के का यह तरीका रोगी के नमूने प्राप्त करने और व्यक्ति को छान से भी सस्ता और अधिक समय कुशल हैप्रोटीन और एंजाइम। नमूने के बीच परिवर्तनशीलता प्लाज्मा में अन्य प्रोटीन का एक परिणाम के रूप में वहाँ नहीं था कि इतने इसके अलावा, थक्के synthesize करने के लिए अलग कर दिया प्रोटीन और एंजाइम का उपयोग करके, थक्के मानकीकृत किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोग राज्यों में थक्के तंत्र की संरचना के बारे में सार्थक डेटा प्राप्त करने के लिए, यह इन परिस्थितियों में प्रोटीन और कोशिकाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के थक्के में शामिल कारकों को अलग-थलग करने के लिए…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. . Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).
- Lindman, H. R. . Analysis of variance in experimental designs. , (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).
