Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em> Xenopus</em
Summary
È stato sviluppato un metodo per quantificare l'entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti.
Abstract
Xenopus è diventato uno strumento importante per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale e difetti. Un metodo per quantificare lo sviluppo oro-facciale consentirà un'analisi più rigorosa dei fenotipi orofacciali su abrogazione con sostanze che possono geneticamente o molecolarmente manipolare l'espressione genica e la funzione delle proteine. Utilizzando due immagini tridimensionali delle teste embrionali, si misurano le dimensioni-come tradizionali dimensioni come larghezza oro-facciale, altezza e Area-. Inoltre, una misura rotondità della apertura della bocca embrionale è usato per descrivere la forma della bocca. Morfometria geometrica di queste due immagini tridimensionali viene eseguita anche per fornire una visione più sofisticata di cambiamenti nella forma della regione oro-facciale. Luoghi di interesse sono assegnati a punti specifici della regione oro-facciale e le coordinate vengono creati. Una analisi delle componenti principio viene utilizzato per ridurre le coordinate punto di riferimento ai componenti principali che poi discriminano il trattamentogruppi. Questi risultati sono visualizzati sotto forma di un diagramma a dispersione in cui gli individui con forme oro-facciali simili si raggruppano. E 'utile anche per eseguire un'analisi funzione discriminante, che mette a confronto statisticamente le posizioni dei punti di riferimento tra i due gruppi di trattamento. Questa analisi viene visualizzato su una griglia di trasformazione in cui i cambiamenti della posizione di riferimento sono visti come vettori. Una griglia viene sovrapposta questi vettori in modo che un modello di deformazione viene visualizzato per mostrare dove posizioni significative punto di riferimento sono cambiati. Cambia forma per l'analisi della funzione discriminante si basano su una misura statistica, e quindi possono essere valutati da un p-value. Questa analisi è semplice e accessibile, che richiede solo uno stereoscopio e software freeware, e quindi sarà una risorsa per la ricerca e l'insegnamento prezioso.
Introduction
Tra i tipi più diffusi e devastanti di difetti alla nascita dell'uomo sono quelli che riguardano la bocca e la faccia, come la schisi orofacciali 1. I bambini con strutture orofacciali malformati sottoposti a interventi chirurgici multipli per tutta la vita e lottano con malformazioni del viso, discorso, dell'udito e problemi alimentari. Pertanto, facilitando nuove ricerche nello sviluppo cranio-oro-facciale ed è fondamentale per la prevenzione e il trattamento di questi tipi di difetti alla nascita negli esseri umani. Xenopus laevis è emerso come un nuovo strumento per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale (alcuni esempi includono 2,3,4 -11). Pertanto, un metodo quantitativo per analizzare dimensione e forma cambia durante lo sviluppo della testa e del viso di questa specie potrebbe essere molto potente 3.
Qui vi presentiamo un tale metodo; Combinando le misurazioni tradizionali dimensioni con morfometria geometrica adattati da uno studio di Xenopus 12 </sup> e un gran numero di studi che hanno analizzato forma del viso umano 13-15. L'obiettivo di questo protocollo è quello di permettere ai ricercatori di quantificare le dimensioni e le forme del viso per distinguere tra diversi fenotipi orofacciali durante lo sviluppo normale e anormale. Questa analisi consentirà una migliore differenziazione tra i difetti cranio-facciali sottili, come quelli derivanti da effetti sinergici di geni e / o fattori ambientali. Inoltre, questo metodo di quantificazione potrebbe anche rivelare anche lieve miglioramento o al salvataggio di un difetto oro-facciale. Questo rende quindi una guida utile per analizzare potenziali terapie.
La combinazione di misurazioni facciali e morfometria geometrica che qui presentiamo consente un'analisi statistica più completa di dimensioni e la forma della regione orofacciale di protocolli attuali che in gran parte utilizzano solo uno o l'altro 15-18. Inoltre, presentiamo un modo semplice per valutare sia mediale e piani lateraliil volto senza bisogno di sofisticate apparecchiature di imaging tridimensionale utilizzata in studi attuali 13,19.
Dimostriamo questo protocollo su Xenopus laevis embrioni trattati con un inibitore del recettore dell'acido retinoico che induce lo sviluppo oro-facciale anormale e una mediana palatoschisi 2,3. La quantificazione delle dimensioni e la forma della regione oro-facciale in questi embrioni ha rivelato cambiamenti nella midface che è analogo per l'uomo con crepacci palatali simili e modelli murini 20,21. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli effetti di altri composti sullo sviluppo oro-facciale, quali sostanze naturali, erbicidi, o proteine come i fattori di crescita. Inoltre, le dimensioni e la forma cambia orofacciali derivanti dalla perturbazione di espressione genica tramite la perdita o il guadagno di esperimenti di funzione (utilizzando Morpholinos antisenso o Crispers / Talens) possono essere quantificati con questo protocollo. Infine, abbiamo sviluppato questo metodo SPECIFICHElly per valutare la morfologia Xenopus; tuttavia, è facilmente modificato per l'analisi di qualsiasi vertebrato. Altre applicazioni potrebbero anche includere l'uso di questo protocollo per il confronto di specie strettamente collegate agli studi evolutivi o ecologici. Mentre l'esempio forniamo qui utilizza questo protocollo per descrivere l'analisi della regione oro-facciale, potrebbe facilmente essere modificato per l'analisi di altre regioni, organi o strutture.
Questo protocollo quantificazione oro-facciale diventerà una risorsa preziosa per la comunità di ricerca, così come un eccellente strumento didattico per gli studenti universitari come un video dimostrativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis è diventato uno strumento utile per sezionare i meccanismi di sviluppo di sviluppo oro-facciale sottostante; tuttavia, attualmente non esistono protocolli che descrivono dimensioni e la forma cambiamenti di questa regione in rane. Il metodo qui descritto contribuirà in modo significativo al settore dello sviluppo oro-facciale, consentendo per la più rigorosa quantificazione dei fenotipi orofacciali in Xenopus e altri vertebrati.
Il primo aspetto, più crit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fondi di start-up di A. Dickinson da VCU sostenuto questo lavoro.
Gli autori desiderano ringraziare Dan Nacu per il suo talento artistico nel creare la rappresentazione schematica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
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