Количественная оценка Орофациальные фенотипов в<em> Xenopus</em
Summary
Метод количественного определения орофациальная размер и форму эмбрионов Xenopus Laevis была разработана. В этом протоколе, традиционные измерения размеров в сочетании с геометрической морфометрии, чтобы обеспечить более сложных анализов орофациального развития и дефектов.
Abstract
Xenopus стала важным инструментом для вскрытия механизмов, регулирующих черепно-лицевого развития и дефекты. Метод количественной орофациальная развитие позволит более тщательного анализа орофациальных фенотипов при отмене с веществами, которые могут генетически или молекулярно манипулировать экспрессию гена или функцию белка. Использование двухмерных изображений эмбриональных руководителей, традиционные размеры-такие размеры как орофациалъная ширине, высоте и региональное измеряются. Кроме того, округлость мера эмбриональной открывания рта используется для описания формы полости рта. Геометрической морфометрии этих двух одномерных изображений также выполняется для обеспечения более сложный вид изменений в форме орофациального области. Достопримечательности присваиваются определенные точки в орофациалъная области и координаты создаются. Принцип анализа компонент используется для снижения ориентиров координаты на основных компонентов, которые затем являются дискриминационными лечениегруппы. Эти результаты отображаются в виде диаграммы рассеяния, в которых люди с подобными орофациальных форм кластерного вместе. Это также полезно, чтобы выполнить дискриминантный анализ, который статистически сравнивает позиции ориентиров между двумя группами лечения. Этот анализ отображается на сетке, где преобразования изменения в положении знакового рассматриваются как векторы. Сетка накладывается на этих векторов, так что отображается картина деформации, чтобы показать, где значительные позиции ориентир изменились. Изменяет свою форму в анализе дискриминантной функции основаны на статистической мерой, и, следовательно, может быть оценена с помощью р-значение. Этот анализ является простым и доступным, требуя только стереоскоп и бесплатным программным обеспечением, и, таким образом, будет ценным исследовательским и учебным ресурсом.
Introduction
Среди наиболее распространенных и разрушительных видов врожденных дефектов человека являются те, которые затрагивают рот и лицо, такие, как орофациальных расщелин 1. Дети с пороками развития орофациальных структур пройти несколько операций на протяжении всей их жизни, и бороться с лица уродствами, речи, слуха и проблемами питания. Поэтому, облегчая новые исследования в черепно-и орофациалъная развития имеет первостепенное значение для профилактики и лечения этих видов врожденных дефектов у человека. Xenopus Laevis появился как новый инструмент для рассечения механизмы, регулирующие черепно-лицевого развития (некоторые примеры включают 2,3,4 -11). Таким образом, количественный метод для анализа размера и формы изменения в процессе развития головы и лица этого вида может быть очень мощным 3.
Здесь мы представляем такой метод; сочетая традиционные измерения размера с геометрической морфометрии, адаптированных из исследования Xenopus 12 </SUP> и богатство исследований, анализирующих человеческую форму лица 13-15. Цель этого протокола является предоставление исследователям количественно размер лица и фигуры различать орофациальных фенотипов при нормальной и аномальной развития. Этот анализ позволит лучше дифференциации между тонкими черепно-лицевых дефектов, таких как те, что возникают из синергетических эффектов генов и / или экологических факторов. Кроме того, этот метод количественного определения может также выявить даже незначительное улучшение или спасение в орофациалъная дефекта. Это, следовательно, делает его полезным руководством при анализе потенциальных терапевтических.
Сочетание измерений лица и геометрической морфометрии, которые мы представляем здесь позволяет применять более комплексный статистический анализ и по размеру и форме орофациалъная регионе, чем в настоящее время протоколов, которые в значительной степени использовать только один или другой 15-18. Кроме того, мы представляем простой способ оценить как средние и боковые плоскостиЛицо, не требуя сложной трехмерной оборудования изображений, используемые в текущих исследованиях 13,19.
Покажем это протокол на Xenopus Laevis эмбрионов, обработанных ретиноевой ингибитора рецептора кислоты, что вызывает аномальные орофациальная развитие и средний нёба 2,3. Количественное определение размеров и формы орофациального области в этих эмбрионов выявил изменения в средней зоне лица, которое аналогично людей с аналогичными небных расщелин и мышиных моделях 20,21. Тем не менее, этот протокол может быть использован, чтобы оценить эффекты соединений на других орофациального развития, таких как природные вещества, гербициды, или белков, таких как факторы роста. Кроме того, орофациальная размера и формы изменения, связанные с возмущением экспрессии генов посредством потери или приобретения функциональных опытах (с использованием антисмысловых Morpholinos или Crispers / Talens) могут также быть количественно с использованием этого протокола. Наконец, мы разработали этот метод specificaLLY оценить Xenopus морфологию; Тем не менее, он легко модифицированы для анализа любого позвоночного животного. Другие приложения также могут включать в себя, используя этот протокол для сравнения близких видов для эволюционных или экологических исследованиях. Хотя пример мы предоставляем здесь использует этот протокол для описания анализ орофациалъная регионе, она может быть легко модифицирована для анализа других регионах, органов или структур.
Это орофациалъная протокол количественное станет ценным ресурсом для научного сообщества, а также отличным инструментом обучения для студентов в качестве демонстрации видео.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus Laevis стала полезным инструментом для рассечения развития механизмов, лежащих орофациальная развития; Однако, есть в настоящее время нет протоколы, описывающие размер и форму изменения этого региона в лягушек. Метод, описанный здесь, будет в значительной степени способствоват?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Пусконаладочные деньги на А. Дикинсон из VCU поддержали эту работу.
Авторы хотели бы выразить признательность Дэну Nacu для его художественного таланта в создании схематическое изображение.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).
- Nieuwkoop, P. D. a. F. J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. . P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).
