口腔顔面表現型の定量化で<em>アフリカツメガエル</em
Summary
アフリカツメガエル胚の顔面サイズおよび形状を定量化する方法が開発されている。このプロトコルでは、従来の大きさの測定は、口腔顔面開発や欠陥のより高度な分析を可能にするために、幾何学的形態計測と組み合わされる。
Abstract
アフリカツメガエルは、頭蓋顔面の開発や欠陥を支配するメカニズムを解剖するための重要なツールとなっています。口腔顔面開発を定量化する方法は、遺伝的または分子的遺伝子発現またはタンパク質機能を操作することができる物質と廃止時顔面表現のより厳密な分析を可能にする。胚の頭部の二次元画像を用いて、従来のサイズの寸法を、そのような口顔の幅、高さ及び面積 – を計測する。また、胚口開口部の真円度測定は、口の形状を説明するために使用される。これらの二次元画像の幾何学的形態計測はまた、口腔顔面領域の形状の変化をより洗練されたビューを提供するために行われる。ランドマークは、口腔顔面領域内の特定のポイントに割り当てられ、座標が作成されます。主成分分析は、その後の処置を判別主成分にランドマークの座標を低減するために使用されるグループ。これらの結果は、類似した口腔顔面形状の個人が一緒にクラスター化した散布図として表示されます。これは、統計的に両群間のランドマークの位置を比較し、判別関数分析を実行することも有用である。この分析は、ランドマークの位置の変化は、ベクトルとして見られる変換グリッドに表示される。グリッドはワーピングパターンがかなりのランドマークの位置が変更されている場所を示すために表示されるように、これらのベクターに重畳される。判別関数分析における形状の変化は、統計的尺度に基づいており、したがって、p値によって評価することができる。この分析は、唯一のステレオスコープやフリーウェアのソフトウェアを必要とし、シンプルかつアクセス可能であるため、貴重な研究と教育のリソースとなります。
Introduction
人間の先天性欠損症の最も一般的かつ破壊的な種類の中には、口腔顔面裂1として、口や顔に影響を与えるものである。不正な形式の口腔顔面構造を持つ子どもたちが生涯にわたって、複数の手術を受け、顔面disfigurements、スピーチ、聴力や食の問題に苦労しています。したがって、cranio-および口腔顔面開発に新たな研究を促進することは、ヒトにおける先天性欠損、これらのタイプの予防と治療に最も重要である。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発を支配するメカニズムを解剖するための新しいツールとして浮上している（いくつかの例は、2,3,4を含む-11）。したがって、この種の頭部の発達と顔の間に大きさや形状変化を分析するための定量的な方法は3非常に強力である可能性があります。
ここでは、そのような方法を提示する。 アフリカツメガエルの研究12から適応幾何学的形態計測を持つ伝統的なサイズ測定を組み合わせる</人間の顔の形13-15を分析する研究のSUP>と富。このプロトコルの目的は、研究者は、正常および異常な発達の間の異なる顔面表現型を区別するために、顔の大きさや形状を定量化できるようにすることである。この分析は、遺伝子および/または環境要因の相乗効果に起因するもののような微妙な顔面頭蓋の欠陥との間のより良好な区別を可能にする。さらに、この定量方法は、また口腔顔面欠陥の場合でもわずかな改善や救助を明らかにできた。したがって、これはそれの潜在的治療薬の分析に有用な指針になります。
ここで提示する顔の測定値と幾何形態計測の組み合わせは、大部分が1つまたは他の15-18を利用し 、現在のプロトコルよりも口腔顔面領域の大きさと形状の両方のより総合的な統計分析を可能にする。さらに、我々はの内側および外側面の両方を評価するための簡単な方法を提示現在の研究13,19で使用される洗練された三次元画像装置を必要とせずに、顔。
私たちは、 アフリカツメガエルでこのプロトコルは、異常な口腔顔面開発および中央値口蓋裂2,3を誘導するレチノイン酸受容体阻害剤で処理された胚をツメガエル実証する。これらの胚における口腔顔面領域の寸法及び形状の定量化は、類似の口蓋裂およびマウスモデル20,21を有するヒトに類似している顔面の変化を明らかにした。しかしながら、このプロトコルは、成長因子などの天然物質、除草剤、またはタンパク質などの口腔顔面開発に関する他の化合物の効果を評価するために利用することができる。さらに、損失または機能実験のゲインを介して遺伝子発現の摂動から生じる口腔顔面の大きさ及び形状の変化（アンチセンスまたはモルホリノCrispersを使用するには、/ Talens）もまた、このプロトコルを使用して定量することができる。最後に、我々は、このメソッド書または仕様書を開発LLY アフリカツメガエルの形態を評価する。しかしながら、容易に任意の脊椎動物の分析のために修正される。他のアプリケーションも、進化や生態の研究のために密接に関連した種を比較するため、このプロトコルを使用して含めることができます。ここで提供する例は、口腔顔面領域の分析を記述するためにこのプロトコルを利用するが、それは容易に他の領域、臓器または構造の分析のために修正することができる。
この口腔顔面定量化プロトコルは、研究コミュニティのための貴重な資源だけでなく、ビデオのデモンストレーションとして学部学生のための優れた教育ツールとなります。
Protocol
Representative Results
Discussion
アフリカツメガエルは、発達のメカニズム基礎口腔顔面開発を解剖するための有用なツールとなっています。しかし、カエルは、この領域の大きさや形状変化を記述するないプロトコルは現在ありません。ここで説明する方法では、アフリカツメガエルや他の脊椎動物における口腔顔面の表現型のより厳密な定量化を可能にすることによって口腔顔面開発の分野に大きく貢献し…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VCUからA·ディキンソンのスタートアップ資金がこの作品を支持した。
著者は、概略図を作成する際に、彼の芸術的才能のためのダンNacuを認識したい。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
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