Kvantifisering av Orofacial fenotyper i<em> Xenopus</em

Summary

En fremgangsmåte for å kvantifisere orofacial størrelsen og formen av Xenopus laevis embryoer har blitt utviklet. I denne protokollen, er tradisjonell størrelse målinger kombinert med geometriske morphometrics å tillate mer sofistikerte analyser av orofacial utvikling og defekter.

Abstract

Xenopus har blitt et viktig verktøy for å dissekere de mekanismene som styrer craniofacial utvikling og defekter. En metode for å kvantifisere orofacial utviklingen vil tillate mer grundig analyse av orofacial fenotyper ved opphevelse med stoffer som genetisk eller molekylært kan manipulere genuttrykket eller protein funksjon. Ved hjelp av todimensjonale bilder av embryonale hoder, er tradisjonelle dimensjoner-en slik størrelse som orofacial bredde, høyde og området-målt. I tillegg er en rundhet mål på den embryoniske munnåpningen brukt for å beskrive formen av munnen. Geometriske morphometrics av ​​disse to dimensjonale bilder blir også utført for å tilveiebringe en mer sofistikert riss av endringer i formen av orofacial regionen. Landemerker er tildelt spesifikke punkter i orofacial regionen og koordinatene er opprettet. Et prinsipp komponentanalyse anvendes for å redusere Landmark koordinater til prinsipielle komponenter som deretter diskriminere behandlingengrupper. Disse resultatene vises som et punktplott som personer med lignende orofacial former klynge sammen. Det er også nyttig å utføre en funksjon diskriminant analyse, som statistisk sammenligner posisjonene til landemerker mellom to behandlingsgruppene. Denne analysen vises på en transformasjon rutenett der endringer i landemerke posisjon blir sett på som vektorer. Et rutenett legges oppå disse vektorer slik at en fordreining mønster vises for å vise hvor viktig kjennetegn er flyttet. Formendringer i diskriminant funksjonsanalysen er basert på et statistisk mål, og kan derfor bli vurdert av en p-verdi. Denne analysen er enkel og tilgjengelig, krever bare et stereoskop og freeware programvare, og dermed vil være en verdifull forskning og undervisning ressurs.

Introduction

Blant de mest utbredte og ødeleggende typer av humant fødselsskader er de som påvirker munn og ansikt, slik som orofacial kløfter ^en. Barn med misdannede orofacial strukturer gjennomgå flere operasjoner i hele sin levetid, og sliter med ansikts disfigurements, tale, hørsel og spiseproblemer. Derfor er av vesentlig betydning for forebygging og behandling av disse typer misdannelser tilrettelegge ny forskning i cranio- og orofacial utvikling hos mennesker. Xenopus laevis har dukket opp som et nytt verktøy for å dissekere de mekanismene som styrer craniofacial utvikling (noen eksempler er ^{2,3,4 -11).} Derfor kan en kvantitativ metode for å analysere størrelse og form endres under utviklingen av hodet og ansiktet av denne arten være svært kraftig ^tre.

Her presenterer vi en slik metode; kombinerer tradisjonelle målinger størrelse med geometriske morphometrics tilpasset fra en Xenopus studie ¹² </sup> og et vell av studier analysere menneskelig ansikts skjema ^13-15. Målet med denne protokollen er å tillate forskere å kvantifisere ansikts størrelse og former for å skille mellom ulike orofacial fenotyper under normal og unormal utvikling. Denne analysen vil gi rom for bedre differensiering mellom subtile kraniofaciale defekter som dem som skyldes synergieffekter av gener og / eller miljømessige faktorer. I tillegg kan dette kvantifisering metoden også avsløre enda liten forbedring eller redning av en orofacial defekt. Dette gjør det derfor en nyttig guide i å analysere mulige behandlingsformer.

Kombinasjonen av ansikts målinger og geometriske morphometrics som vi presenterer her gjør det mulig for en mer omfattende statistisk analyse av både størrelsen og formen på den orofacial region enn nåværende protokoller som i stor grad utnytter bare den ene eller den andre ^15-18. Videre presenterer vi en enkel måte å vurdere både den mediale og laterale flyene avansiktet uten å kreve avansert tredimensjonal bildeutstyr som brukes i dagens studier ^13,19.

Vi demonstrerer denne protokollen på Xenopus laevis embryoer behandlet med en retinsyrereseptor hemmer som induserer unormal orofacial utvikling og en median ganespalte ^2,3. Kvantifisering av dimensjonene og formen på orofacial regionen i disse embryoer har avdekket endringer i midface som er analog til mennesker med liknende palatal kløfter og musemodeller ^20,21. Imidlertid kan denne protokollen benyttes for å vurdere effekten av andre forbindelser på orofacial utvikling som naturlige stoffer, plantevernmidler, eller proteiner som vekstfaktorer. Videre orofacial størrelse og form endringer som følger av endringen av genekspresjon via tap eller gevinst på funksjons eksperimenter (ved hjelp av antisense morpholinos eller Crispers / Talens) også kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen. Til slutt, har vi utviklet denne metoden spesifikasjonlly å vurdere Xenopus morfologi; men det er imidlertid lett modifiseres for analyse av en hvilken som helst vertebrat. Andre programmer kan også omfatte å bruke denne protokollen for å sammenligne nært beslektede arter for evolusjonære eller økologiske studier. Mens eksempelet vi tilbyr her benytter denne protokollen å beskrive analyse av orofacial regionen, kan det lett bli endret for analyse av andre regioner, organer eller strukturer.

Dette orofacial kvantifisering protokollen vil bli en verdifull ressurs for forskersamfunnet, samt en utmerket læringsverktøy for lavere grads studenter som en video demonstrasjon.

Protocol

Alle eksperimenter utført ved hjelp Xenopus laevis har blitt godkjent av IACUC (protokoll # AD20261). 1. Forberede Reagenser og nødvendige materialer Reagenser: Lag 1 liter 10x MBS (Modified Barths Saline) løsning 22. Legg NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), og NaHCO3 (25 mM) til 1 liter destillert vann. Juster pH til 7,8 med NaOH. Lag 1 L av 1 x MBS ved å fortynne 100 ml av 10x MBS-oppl…

Representative Results

Her ble en kvantitativ analyse av orofacial størrelse og form demonstrert å sammenligne embryoer behandlet med retinsyre-reseptor inhibitor (inhibitor RAR) til ubehandlede kontroller. Embryoene ble behandlet med en 1fiM konsentrasjon av denne kjemiske hemmer fra scenen 24-30 (26-35 HPF), vasket ut, og fikset på scenen 42 (82 HPF). De ble deretter behandlet og analysert som beskrevet i protokollen. Resultatene er originale data, men i samsvar med observasjoner i tidligere publikasjoner 2,3. Kontroll embryoe…

Discussion

Xenopus laevis har blitt et nyttig verktøy for å dissekere den utviklingsmessige mekanismer underliggende orofacial utvikling; men det er for øyeblikket ingen protokoller som beskriver størrelse og form endringer i denne regionen i frosker. Metoden som beskrives her vil bidra vesentlig til feltet av orofacial utvikling ved å tillate for strengere kvantifisering av orofacial fenotyper i Xenopus og andre virveldyr.

Den første, mest kritiske aspekt ved riktig utførelse …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dissecting microscope	Zeiss		fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-10
Sterile, disposable scalpel	Sklar	06-2015
24-well plate	Fisher Scientific	087721
Standard Disposable transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
150 mm X 15 mm Petri dishes	Falcon	351058
Incubators	Ectotherm		set to 15C or 20C
Modeling Clay	Premo, or other non-toxic modeling clay		in black or white
Straight teasing needle	Thermo Scientific	19010
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97	Sutter Instrument Co,	Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B	For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.
Pipettemen	Gilson	F144802, F123600, F123602
BMS-453	Tocris	3409
DMSO	American Bioanalytical	AB00435-01000
Cysteine	Sigma-Aldrich	52-90-4
Paraformaldehyde powder	Sigma-Aldrich	158127
Petri dishes	Falcom	353003, 351058	100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol	VWR	89125-170