Kvantifiering av Orofacial fenotyper in<em> Xenopus</em

Summary

En metod för att kvantifiera orofacial storleken och formen av Xenopus laevis embryon har utvecklats. I detta protokoll är traditionella storleksmätningar i kombination med geometriska Morfometri att möjliggöra mer avancerade analyser av orofacial utveckling och defekter.

Abstract

Xenopus har blivit ett viktigt verktyg för att dissekera de mekanismer som styr kraniofaciala utveckling och defekter. En metod för att kvantifiera orofacial utveckling kommer att möjliggöra mer noggrann analys av orofaciala fenotyper vid upphävande med ämnen som är genetiskt eller molekylärt kan manipulera genuttryck eller proteinfunktion. Med hjälp av två dimensionella bilder av embryonala huvuden, är traditionella storleksmått-såsom orofacial bredd, höjd och områdes mäts. Dessutom är en rundhet mått på den embryonala mynningsöppningen används för att beskriva formen på munnen. Geometriska Morfometri av dessa två dimensionella bilder utförs också för att tillhandahålla en mer sofistikerad vy över förändringar i formen av den orofaciala området. Sevärdheter delas särskilda punkter i orofaciala regionen och koordinater skapas. En princip komponentanalys används för att minska landmärke koordinaterna till huvudkomponenterna som sedan diskriminerar behandlingengrupper. Dessa resultat visas som en punktdiagram där individer med liknande orofaciala former kluster tillsammans. Det är också användbart för att utföra ett urskiljningsfunktionen analys, som statistiskt jämför positionerna för de landmärken mellan två behandlingsgrupper. Denna analys visas på en omvandling nätet där förändringar i landmärke ställning betraktas som vektorer. Ett rutnät ovanpå dessa vektorer så att ett varpmönster visas för att visa var betydande landmärke ställning har förändrats. Formförändringar i analysen urskiljningsfunktionen baseras på ett statistiskt mått, och kan därför utvärderas genom att ett p-värde. Denna analys är enkel och tillgänglig, som endast kräver en stereoskop och freeware programvara, och därmed kommer att bli en värdefull forskning och undervisning resurs.

Introduction

Bland de vanligaste och förödande typer av humana fosterskador är de som berör munnen och ansiktet, till exempel orofaciala klyftor ^1. Barn med missbildade orofaciala strukturer genomgår flera operationer under hela sin livstid och kämpar med ansikts vanställdhet, tal, hörsel och ätproblem. Därför underlättar ny forskning i cranio- och orofacial utveckling är avgörande för att förebygga och behandla dessa typer av fosterskador hos människor. Xenopus laevis har vuxit fram som ett nytt verktyg för att dissekera de mekanismer som styr kraniofaciala utveckling (några exempel är ^{2,3,4 -11).} Därför skulle en kvantitativ metod för att analysera storlek och formförändringar under utvecklingen av huvudet och ansiktet av denna art är mycket kraftfull ^3.

Här presenterar vi en sådan metod; kombinerar traditionella storleksmätningar med geometriska Morfometri anpassas från en Xenopus studie ¹² </sup> och en uppsjö av studier som analyserar människans ansikts formulär ^13-15. Målet med detta protokoll är att göra det möjligt för forskare att kvantifiera ansikts storlek och former för att skilja mellan olika orofaciala fenotyper under normal och onormal utveckling. Denna analys kommer att möjliggöra en bättre differentiering mellan subtila kraniofaciala defekter såsom sådana som härrör från synergistiska effekter av gener och / eller miljömässiga faktorer. Dessutom kan denna kvantifiering metoden också avslöjar även svag förbättring eller räddning av en orofacial defekt. Det gör därför en användbar guide i att analysera potentiella läkemedel.

Kombinationen av ansikts mätningar och geometriska Morfometri som vi presenterar här möjliggör en mer omfattande statistisk analys av både storlek och form på orofaciala regionen än dagens protokoll som till stor del använder bara det ena eller det andra ^15-18. Vidare presenterar vi ett enkelt sätt att bedöma både den mediala och laterala planansiktet utan att det krävs avancerad tredimensionell avbildningsutrustning som används i löpande undersökningar ^13,19.

Vi visar detta protokoll om Xenopus laevis embryon som behandlats med en retinsyrareceptor hämmare som inducerar onormal orofaciala utveckling och en median gomspalt ^2,3. Kvantifiering av dimensionerna och formen av det orofaciala området i dessa embryon har avslöjat förändringar i ansiktet som är analogt till människor med liknande palatinala klyftor och musmodeller ^20,21. Dock kan detta protokoll användas för att bedöma effekterna av andra föreningar på orofacial utveckling såsom naturämnen, herbicider, eller proteiner såsom tillväxtfaktorer. Vidare, orofaciala storlek och formförändringar till följd av störning av genuttryck via förlust eller vinst på funktions experiment (med antisens morpholinos eller Crispers / Talens) kan också kvantifieras med hjälp av detta protokoll. Slutligen har vi utvecklat denna metod specifically att bedöma Xenopus morfologi; dock är det lätt modifieras för analys av alla ryggradsdjur. Andra tillämpningar kan också innefatta användning av detta protokoll för att jämföra närbesläktade arter för evolutionära och ekologiska studier. Medan det exempel vi ger här använder detta protokoll för att beskriva analys av den orofaciala området, kunde den lätt modifieras för analys av andra regioner, organ eller strukturer.

Denna orofacial kvantifiering protokoll kommer att bli en värdefull resurs för forskarsamhället, samt ett utmärkt pedagogiskt hjälpmedel för studenter som en videodemonstration.

Protocol

Alla experiment utförda med hjälp av Xenopus laevis har godkänts av IACUC (protokoll # AD20261). 1. Förbereda Reagens och Material som behövs Reagens: Gör 1 liter 10x MBS (Modified Barths Saline) lösning 22. Lägg NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) och NaHCO 3 (25 mM) till en L destillerat vatten. Justera pH till 7,8 med NaOH. Gör en L 1X MBS genom att späda 100 ml av 10x MBS-lösn…

Representative Results

Här gjordes en kvantitativ analys av orofacial storlek och form visade att jämföra embryon som behandlats med en retinsyra-receptor-inhibitor (RAR-hämmare) till obehandlade kontroller. Embryon behandlades med en 1 ^ M koncentration av denna kemiska hämmaren från steg 24 till 30 (26-35 HPF), tvättas ut och fixeras vid steg 42 (82 HPF). De bearbetades därefter och analyserades såsom beskrivs i protokollet. Resultaten är originaldata, men i linje med observationer i tidigare publikationer 2,3. Embryon …

Discussion

Xenopus laevis har blivit ett användbart verktyg för att dissekera de utvecklings- mekanismerna bakom orofacial utveckling; Det finns dock för närvarande inga protokoll som beskriver storlek och formförändringar i denna region i grodor. Den metod som beskrivs här kommer att bidra avsevärt till området för orofacial utveckling genom att tillåta mer rigorös kvantifiering av orofaciala fenotyper i Xenopus och andra ryggradsdjur.

Den första, mest kritiska aspekten …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Dissecting microscope	Zeiss		fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-10
Sterile, disposable scalpel	Sklar	06-2015
24-well plate	Fisher Scientific	087721
Standard Disposable transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
150 mm X 15 mm Petri dishes	Falcon	351058
Incubators	Ectotherm		set to 15C or 20C
Modeling Clay	Premo, or other non-toxic modeling clay		in black or white
Straight teasing needle	Thermo Scientific	19010
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97	Sutter Instrument Co,	Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B	For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.
Pipettemen	Gilson	F144802, F123600, F123602
BMS-453	Tocris	3409
DMSO	American Bioanalytical	AB00435-01000
Cysteine	Sigma-Aldrich	52-90-4
Paraformaldehyde powder	Sigma-Aldrich	158127
Petri dishes	Falcom	353003, 351058	100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol	VWR	89125-170