Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Summary

Le poisson zèbre est un excellent organisme expérimental pour étudier les processus de développement de vertébrés et modèle des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole sur la façon d'effectuer un écran chimique à haut débit manuel embryons de poisson zèbre avec un ensemble de montage hybridation in situ (WISH) lecture.

Abstract

Le poisson zèbre sont devenus un organisme modèle largement utilisé pour étudier les mécanismes qui sous-tendent la biologie du développement et d'étudier la pathologie de la maladie humaine en raison de leur degré élevé de conservation des ressources génétiques avec les humains. génétique chimiques implique de tester l'effet que les petites molécules ont un processus biologique et devient une méthode de recherche translationnelle populaire pour identifier des composés thérapeutiques. Le poisson zèbre sont spécifiquement appel à utiliser pour la génétique chimiques en raison de leur capacité à produire de grandes griffes d'embryons transparents, qui sont à l'extérieur fécondés. En outre, les embryons de poisson zèbre peut être facilement traité par le médicament par la simple addition d'un composé aux médias de l'embryon. Utilisation de l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) dans, expression de l'ARNm peut être clairement visualisée dans embryons de poisson zèbre. Ensemble, grâce à la génétique chimiques et que vous souhaitez, le poisson zèbre devient un contexte de l'organisme entier puissant dans lequel pour déterminer le cellulaire et physiologiqueeffets de petites molécules. Avancées innovantes ont été réalisés dans les technologies qui utilisent des procédures de dépistage basés sur les machines, mais pour de nombreux laboratoires de telles options ne sont pas accessibles ou restent coût prohibitif. Le protocole décrit ici explique comment exécuter un écran manuel génétique à haut débit chimique qui nécessite des ressources de base et peut être accompli par une seule équipe ou un petit en une période de temps efficace. Ainsi, ce protocole prévoit une stratégie réalisable qui peut être mis en œuvre par des groupes de recherche à effectuer génétique chimiques chez le poisson zèbre, qui peut être utile pour obtenir des aperçus fondamentaux sur les processus de développement, les mécanismes de la maladie, et d'identifier de nouveaux composés et les voies de signalisation qui ont des applications médicales pertinentes .

Introduction

L'identification de médicaments thérapeutiques efficaces pour traiter la maladie humaine est la phase finale pour de nombreux chercheurs biomédicaux. Bien que l'identification et la caractérisation des agents pharmacologiques potentiels pour des applications cliniques a un intérêt évident pour la santé, il est resté un défi de taille. En fin de compte, le développement de nombreux composés thérapeutiques vient de la connaissance de la façon dont les types de cellules spécifiques, soit développer ou fonction. Le poisson zèbre, Danio rerio, est un poisson téléostéen d'eau douce de la famille des cyprinidés qui est devenu un organisme modèle dominant en biologie du développement ^1. Le poisson zèbre sont génétiquement vertébrés dociles, faciles à maintenir et manipuler des études scientifiques ^2,3. L'embryon de poisson zèbre est transparent, fertilisé à l'extérieur, et peut être produit par des centaines à partir d'une seule paire d'accouplement adulte en une semaine seulement ^2,3. En outre, les principaux systèmes d'organes et de poisson zèbre d'actions possèdent un grand degree de similitude génétique avec les mammifères, y compris les humains ^4. Il est frappant, 70% des gènes humains ont un orthologue poisson zèbre ^4. En raison de cette similitude, le poisson zèbre ont été un système expérimental très pertinent pour l'étude des mécanismes de développement des vertébrés et de la physiologie, et ont été utilisées pour résumer une multitude de maladies humaines ^5-7. Ces raisons, entre autres, ont fait le candidat idéal pour le poisson-zèbre continue interrogatoires génétiques et a donné lieu à une appréciation sans cesse croissante de l'utilité de poisson zèbre dans la recherche biomédicale ^6,7.

Au cours des dernières décennies, une abondance d'outils génétiques ont été développés dans le poisson-zèbre. Le génome du poisson zèbre se prête à la mutagenèse et la transgenèse ^3. À ce jour, une pléthore de marche avant et arrière des études génétiques ont été réalisées, conduisant à la génération de plus de 9000 mutants ^3. En outre, de nombreuses lignées transgéniques ont êtreen création, qui ont permis l'étiquetage et l'isolement de types cellulaires spécifiques ^3. Il ya eu des efforts considérables et durables pour centraliser et distribuer ces ressources à la communauté de recherche, qui sont accessibles pour les laboratoires à un coût assez faible par le Centre international de ressources de poisson zèbre (ZIRC) ^8. En outre, un vaste dépôt d'informations biologiques et des outils moléculaires, allant de profils d'expression de gènes à morpholino séquences et protocoles, ont été progressivement annotée sur le Réseau d'information de poisson zèbre (ZFIN) ^9-11. Ces infrastructures de recherche de poisson zèbre ont été rendues possibles grâce au soutien important NIH et la promotion de ce modèle animal ^8. Ce cache de mutants de poisson zèbre, les lignées transgéniques et d'informations pertinentes continue d'être d'une valeur exceptionnelle à la communauté de la recherche biologique en général. Cependant, alors que le poisson-zèbre sont maintenant un organisme modèle bien établi et prééminent, ils représentent à largely réservoir inexploité pour étudier la biologie du développement et de la maladie grâce à l'utilisation d'écrans génétiques chimiques.

Génétique chimique est l'utilisation de petites molécules, comme les médicaments ou d'autres composés, d'affecter un processus biologique dans un système de vie ^12. génétique chimiques peuvent être mises en œuvre pour comprendre les mécanismes moléculaires de la fonction des gènes, notamment pour identifier les agents que le sauvetage ou aggraver un défaut génétique spécifique ^12. En outre, la génétique chimique représente une avenue importante pour mener la recherche translationnelle ^12. Alors que les écrans génétiques à terme traditionnels dans des modèles animaux ont été extrêmement puissant pour relier des gènes spécifiques aux maladies, ils manquent une dimension temporelle, ce qui rend difficile ou parfois impossible d'observer des phénotypes qui pourraient surgir après l'embryogenèse précoce. En outre, la redondance génétique peut rendre les résultats observés à partir de la génétique à terme difficile à interpréter. Alternativement, les écrans génétiques chimiquespermettre un contrôle temporelle fine et fournir simultanément un bon point de départ pour la découverte de médicaments ^12,13.

génétique chimiques peuvent être effectuées en utilisant des systèmes in vitro (par exemple, des lignées cellulaires, des protéines) ou à l'aide d'un système in vivo, comme un organisme entier. L'utilisation d'un système in vitro pour la génétique chimique peut être bénéfique, car elle est plus simple qu'un système de l'organisme entier, plus facile à travailler sur une grande échelle, moins coûteux, et moins de temps à forte intensité. En conséquence, les systèmes in vitro permettent à la fois le criblage à haut débit (HTS) et le criblage à haut contenu (HCS). Il existe un certain nombre d'avantages à utiliser un système in vitro qui doit être considéré lors de l'approche génétique chimique, mais aussi des limitations significatives. Une limitation majeure à l'utilisation d'une lignée de cellules est que les petites molécules peuvent être efficace et non toxique en une lignée cellulaire spécifique, encore devenir toxiques lorsqu'ils sont introduits dans un organisme entier. Ainsi, l'essentielde la question est que les systèmes in vitro ne reflètent pas le contexte général d'un organisme et ne sont donc pas toujours en mesure d'imiter avec précision ce qui se passe dans un organisme entier. Alors que les essais en enclos dans des organismes entiers peut contourner ces problèmes, l'utilisation de modèles sur des organismes entiers de mammifères pose un certain nombre de limitations physiques et éthiques. Par exemple, le dépistage de la drogue chez la souris est logistiquement entravée par l'espace et les dépenses nécessaires pour tester un échantillon de taille adéquate. En outre, des questions de développement peuvent être difficiles à étudier, en raison du fait que les mammifères développent in utero. Enfin, alors que la conduite de la recherche biomédicale a une immense valeur pour la société, il existe néanmoins des besoins considérables pour protéger le bien-être des animaux en limitant études intenses et de soulager la douleur et la souffrance des animaux utilisés pour la recherche. Le poisson zèbre fournir un substitut viable à travailler avec les vertébrés supérieurs comme les mammifères, et en outre, de nombreux sujets peuvent être étudiés en utilisant la génétique chimique àles stades embryonnaire et larvaire lors du traitement neurologique est absent ou opératoire à un faible niveau ^12,13.

À ce jour, une myriade d'écrans génétiques chimiques ont été effectuées sur des embryons de poisson zèbre en particulier, que la livraison de composé peut être réalisé en immergeant les embryons dans des milieux contenant le médicament d'intérêt ^12-15. En outre, il ya eu de nombreuses avancées scientifiques et technologiques à réaliser des écrans génétiques chimiques possible et gérable ^16-20. Peterson et ses collègues ont été les premiers à utiliser le poisson zèbre dans un crible génétique chimique en 2000, et plus tard en 2004 ont identifié un composé qui a supprimé une mutation de coarctation de l'aorte chez le poisson zèbre ^21,22. Écrans chimiques ont depuis été mises en œuvre pour étudier plusieurs tissus en développement (par exemple, le cœur, des vaisseaux sanguins), ^23-25 ​​fonctions physiologiques (par exemple, la base neurologique de comportement) ^26, la régénération des adultes ^27,28, et diseas modèles de e (par exemple, la dystrophie musculaire et le cancer) ^29,30. Parmi ces écrans chimiques du poisson zèbre, la découverte que les prostaglandines régulent les cellules souches hématopoïétiques ont été prises pour les essais cliniques chez l'homme, ce qui démontre le pouvoir de passer de "réservoir de chevet" ^23,31-33 (NIH, clinique Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Plus récemment, thérapies prometteuses candidats ont émergé des organes complexes tels que le rein, qui assainir la pathologie cellulaire dans la maladie polykystique des reins (PKD) ³⁴ et l'insuffisance rénale aiguë ^27,35, bien que ceux-ci ont encore à passer à des essais cliniques. Ces cribles génétiques chimiques démontrent l'utilité générale de petits composés tests dans le poisson zèbre développement et la capacité d'appliquer la génétique chimique d'interroger la fonction des tissus adultes. En outre, il ya une liste de plus en plus de collections de pharmacologie disponibles dans le commerce qui sont disponibles pour des études universitaires ^19.

ove_content "> Dans les dernières années, il ya eu des progrès importants dans la technologie de dépistage génétique chimique, y compris l'utilisation de systèmes automatisés de robots pour la distribution de médicaments et de manutention, ainsi que des systèmes d'imagerie automatisés ^36-38. Ces systèmes prévoient la possibilité de tester des milliers de composés à atteindre ces deux HTS et HCS ^36-38. Malheureusement, l'entreprise de cribles génétiques chimiques avec ces entreprises robotiques innovantes exigent généralement des ressources considérables. Ces types de ressources sont un obstacle important pour de nombreuses institutions qui manquent de capitaux pour acquérir , exploiter et entretenir une telle instrumentation. Bien que l'établissement de l'infrastructure pour la manipulation robotique de bibliothèques chimiques, y compris le transfert d'embryons vêtu plaques, reste prohibitif pour de nombreux laboratoires, l'imagerie automatisée et l'analyse est généralement plus accessibles ^12. dépistage automatique des images permet de quantifier de ré transgénique fluorescentporteurs et facilite l'analyse phénotypique spécifique ^12,15.

Bien que les systèmes automatisés représentent des avancées technologiques utiles, de nombreuses questions peuvent être adressées par des écrans manuels plus ciblés, comme la requête de plusieurs milliers de composés biologiquement actifs sur un processus de développement d'un ensemble de montage hybridation in situ (WISH) lecture ^39. En outre, si un nombre croissant de laboratoires ont invoqué écrans chimiques du poisson zèbre pour enquêter sur une question de recherche, peu de saturation (le cas échéant) des efforts ont atteint et de nombreux sujets doivent encore être violé en utilisant la génétique chimique. écrans chimiques peuvent être exécutées à l'aide d'une petite colonie de poisson zèbre composé de seulement un type sauvage ou quelques chars transgéniques. Par conséquent, cette forme d'interrogation génétique devrait être réalisable par la plupart des groupes de recherche intéressés à élargir poisson zèbre / diversification dans ce domaine. Bibliothèques chimiques de taille variable peuvent être achetés auprès d'un distributeur commercial et / ou colcollabo-. Pour ces raisons, la génétique chimiques peuvent être économiquement viable même dans les climats de financement difficiles. Cependant, il ya des obstacles à commencer un écran génétique chimique, tels que la façon de planifier les aspects logistiques de l'écran: par exemple, le nombre de personnes nécessaires pour un écran de succès, la répartition du temps dédié et assemblant un protocole physique à des échantillons manuellement des processus que le nombre des centaines à plusieurs milliers. Ici, nous détaillons un protocole manuel à haut débit d'effectuer génétique chimique dans l'embryon de poisson zèbre à souhait comme une lecture. Cette méthode implique le traitement médicamenteux de embryons de poisson zèbre, suivie d'une détection ribosonde de transcrits d'ARNm. En utilisant ce protocole, une petite équipe ou même un individu peut raisonnablement dépister et analyser une bibliothèque chimique modeste d'environ 600 composés en l'espace de 9 semaines.

Protocol

Les procédures de travail avec le poisson zèbre décrit ici ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et institutionnel à l'Université de Notre Dame. Un guide pour la conception de la recherche pour ce petit écran de molécule manuel dans le poisson-zèbre est fourni (Figure 1). Une vue d'ensemble des méthodes décrites dans ce protocole est fourni sous forme de diagramme de flux (Figure 2). Se il vous plaît se référer à l'exemple de système de marquage (figure 3) pour planifier les étapes de traitement d'embryons décrits dans les parties 4-10. Pour la mise en scène d'embryons, se il vous plaît se référer à la série de la mise en scène de poisson zèbre 40, et pour la préparation de ribosondes antisens WISH utilisés dans les parties 9-10, reportez-vous aux méthodes récemment publiées 41. 1. Préparation de poisson-zèbre accouplement Chambres Placer un poisson zèbre mâle adulte et une femelle adulte de poisson zèbre dans une chambre d'accouplement, séparés par le diviseur de chambre O / N. REMARQUE: accouplements de masse, une telles ceux qui utilisent des groupes de 2-3 et 2-3 femelles mâles peuvent créer plus d'embryons par rapport à accouplements appariés simples, et peut être réalisée avec les chambres d'accouplement de taille appropriée. Répétez l'étape 1.1 de telle sorte qu'un total de 25 paires de poisson zèbre sont mis en place pour chaque plaque de 96 puits de petites molécules qui sera testé. 2. Collecte des embryons de poissons zèbres Le lendemain, retirer le diviseur qui sépare chaque paire de poissons et après 1 h, recueillir embryons de poisson zèbre à l'aide d'une passoire à mailles fines et placez-les dans une boîte de Petri contenant un milieu de embryon E3 (voir la liste du matériel pour la recette). REMARQUE: la collecte des embryons après 1 h assure que les embryons sont à des stades de développement similaires. Utiliser une pipette de transfert en plastique pour enlever les débris (par exemple, de la nourriture et des déchets solides). Ensuite, utilisez une loupe binoculaire pour observer chaque embrayage d'embryons et retirez les œufs non fécondés. Décanter les médias de l'embryon E3 et remplacer avec des produits frais E3, puis placez chaque dish d'embryons dans un incubateur à 28,5 °. Après 2 h observer chaque embrayage d'embryons en utilisant un microscope stéréoscopique et retirez les œufs non fécondés. NOTE: Les œufs non fécondés peuvent empoisonner les autres embryons et apparaîtront à être au stade de la cellule unique ou opaque. Continuer à surveiller les progrès de développement des embryons en utilisant un microscope stéréoscopique jusqu'à ce qu'ils atteignent 40% épibolie. Observer la forme de la sphère de l'embryon qui semble être composée de deux couches séparées au stade 40% de épibolie 40. 3. La dilution chimique Préparation Retirer la plaque chimiothèque de stockage à -80 ° C, le couvrir de papier d'aluminium et décongeler à température ambiante. REMARQUE: Différentes bibliothèques vont fondre à des taux différents en fonction principalement du solvant utilisé. En général, une bibliothèque chimique congelé à -80 ° C est complètement décongelé à environ 3 heures à température ambiante. plaque (s) de décongélation de magasin dans un endroit sûr à l'étiquetage des matières dangereuses appropriée. Porter unelunettes ppropriate, une blouse de laboratoire, et deux ensembles de gants lors de la manipulation des produits chimiques. Utiliser une pipette multicanaux à 8 canaux d'ajouter 99 ul de E3 dans les colonnes 2-12 d'une plaque à 96 puits. NOTE: D'après notre expérience, une gamme appropriée de médicament de départ est de 10 uM – 50 uM, et également comme décrit dans les protocoles actuels 39. Ici, nous démontrons un traitement de 10 uM si vous utilisez une bibliothèque chimique actions plaque de 1 mm. Utilisez une pipette multicanaux à 8 canaux à ajouter 1 pl de chaque composé pour son bien respectif avec l'E3. Utilisez un P10 à 1 ul de DMSO (ou le solvant approprié) dans la colonne de commande (ici, colonne 12). Recouvrir la plaque de dilution chimique d'une feuille d'aluminium, comme la feuille d'aluminium permettra de protéger tous les composés sensibles à la lumière dans la bibliothèque, et retourner la plaque de banque de chimique à -80 ° C pour le stockage. 4. rangeant embryons de poissons zèbres Sélectionnez une boîte de Pétricontenant embryons de poisson zèbre au stade épibolie 40%. En utilisant une pipette de transfert, placer soigneusement environ 10 embryons dans chaque puits d'une (1,1 ml) de profondeur 96 de plaque bien. Distribuer des embryons dans les colonnes 2-12 de la plaque de 96 puits profond. REMARQUE: Le chercheur doit sélectionner le point de temps de plus de médicament qui est mieux adapté au processus de développement qu'ils souhaitent interroger. Utilisation d'une pipette de transfert en plastique peut minimiser les dommages de l'embryon. Depuis traitement de la toxicomanie avant à 40% épibolie peut entraîner une augmentation de la létalité de l'embryon, de développer les embryons de plus avant l'exposition au médicament, en particulier lorsque les processus de développement ultérieurs sont en cours d'examen. Mise en place plus de 15-20 embryons dans chaque puits peut conduire à un retard de développement dû à l'entassement et doit être évitée. Il est important de noter que la plaque à 96 puits profonds contenant les embryons est différente de la plaque à une dilution de 96 chimique. Utiliser une pipette de transfert de verre pour enlever l'excès E3 de chaque puits, et d'expulser l'excès E3 enun récipient à déchets. REMARQUE: Ce processus prend généralement 30 minutes à 1 heure selon la vitesse du chercheur, de sorte que les embryons sont entre 50% et 60% par épibolie achèvement, qui est le stade de développement de cible pour plus de la dilution chimique décrite ici. Le plateau peut être incliné à un angle de 45 ° pour amener les embryons à tomber au fond du puits de sorte que la pointe de la pipette peut être pressée contre le fond du puits pour soutirer l'excès E3. 5. Ajout de traitements chimiques Utilisez une pipette multicanaux à 8 canaux pour transférer les 100 dilutions chimiques ul de leurs puits respectifs de la plaque de 96 puits profonds contenant des embryons de poisson zèbre de rangés. REMARQUE: Assurez-vous que l'emplacement du puits d'origine du composé correspond à l'emplacement du puits dans la plaque de 96 puits profonds correspondant (par exemple, l'emplacement B1 et dans la plaque de dilution chimique est à la pipette dans l'emplacement B1 et dans la profondeurPlaque de 96 puits). Mouiller une serviette en papier et le placer dans un conteneur sensible à la lumière assez grand pour contenir une plaque de 96 puits. NOTE: La serviette en papier humide permet d'éviter l'évaporation de la dilution chimique. Ensuite, utilisez un tapis d'étanchéité pour sceller la plaque puits profond 96, placez-le dans le récipient sensible à la lumière, et incuber à 28,5 ° C. REMARQUE: Laissez les embryons de poisson zèbre développer jusqu'à ce que le lendemain matin. Sinon, laissez les embryons se développent jusqu'au stade approprié de développement pour le processus en cours d'analyse. 6. élimination des produits chimiques Utilisez une pipette multicanaux à 8 canaux à ajouter 300 ul de l'E3 à chaque ligne des puits traités avec le médicament. Aspirer et éliminer la dilution E3 / chimique de chaque rangée de puits. Laver les embryons 3 fois avec 300 pi de l'E3. NOTE: Jeter drogue déchets dans un récipient utilisé uniquement à cette fin. Pour la facilité de lavage, utiliser un bassin de verre rempli d'E3 assez large pour utiliser le multpipette ichannel. 7. Pronase et fixation embryons de poissons zèbres Transfert embryons de poisson zèbre à l'aide d'une pipette de transfert en plastique en quatre plaques à 24 puits, puis retirer les embryons morts. Étiquette les plaques à puits 24 de sorte qu'ils correspondent aux emplacements d'origine et de médicament. Placez la pipette devant un fond sombre après chaque transfert d'embryons et de visualiser à la pipette et à prévenir embryon bien croisé. Utiliser une pipette de transfert en plastique pour prélever E3 afin que les embryons sont à peine immergée dans un liquide. Utilisez une pipette en verre d'ajouter 2 gouttes de pronase actions (50 mg / ml) dans chaque puits. Laissez incuber les embryons dans pronase pendant 5 min, puis agiter les puits pour provoquer le chorion à briser. Alternativement, la pronase les embryons avant qu'ils en sont au stade de développement souhaité pour l'analyse. Utiliser une pipette de transfert en plastique pour laver les embryons à deux reprises avec l'E3. Une fois que les embryons sont au stade d'analyse souhaitée, completely aspirer et éliminer le restant E3. Utiliser une pipette de transfert en plastique pour ajouter frais de 4% PFA / PBS dans chaque puits. Incuber les embryons à 4 ° CO / N à fixer. Utilisez fraîchement décongelé PFA à fixer initialement embryons. REMARQUE: Passez à effectuer votre test d'écran d'intérêt. Détaillée ici dans les sections 8-10 est une procédure pour traiter les plaques d'écran à souhait. Des méthodes alternatives peuvent être substitués comme désiré, puis passez à l'article 11 et d'évaluer les résultats. 8. embryon Perméabilisation Utiliser une pipette de transfert en plastique de soutirage 4% PFA / PBS à partir des embryons et laver les embryons à deux reprises avec 1x (solution saline tamponnée au phosphate avec du Tween) PBST. Transférer les embryons en plaques à 48 puits, puis soutirer le 1x PBST des embryons. Etiqueter les plaques à 48 puits pour correspondre aux emplacements de puits d'origine de la plaque de 96 puits profond. Lavez en ajoutant 100% de méthanol dans les puits à l'aide d'une pipette de transfert en plastique puis soutirer et ajouter 100% methanoL encore aux embryons. Placer les embryons à -20 ° C, et laisser incuber pendant au moins 20 min. Vous pouvez également maintenir les embryons dans 100% de méthanol à -20 ° C pour le stockage à long terme. Retirer le methanol à 100% et laver les embryons avec 50% MeOH / 1 x PBST, puis 30% MeOH / 1 x PBST, et finalement deux fois avec du 1 x PBST. NOTE: Les embryons après la fécondation plus de 24 h (HPF) peut être blanchie à ce stade d'enlever la pigmentation 39. Ajouter 15 ul de proteinase K décongelé stock (10 mg / ml) à 50 ml de 1 x PBST pour préparer une protéinase K (5 ug / ml) de la solution de travail. Retirez le 1x PBST des embryons et ajouter la solution de travail protéinase K. Retirez la protéinase K après 4 min. REMARQUE: L'expérimentateur doit travailler rapidement au cours de cette étape pour éviter la dégradation de l'embryon. Concentration à la protéinase K et la période d'incubation doivent être varié en fonction de l'âge des embryons en cours de traitement 41. Les paramètres décrits ici se rapportent aux embryonsqui sont 24 hpf. Laver les embryons avec 1x PBST, puis ajouter glacée 4% PFA / PBS. Laissez les embryons incuber dans 4% PFA / PBS pendant 20 min à température ambiante. 9. L'hybridation de la sonde et Removal L'utilisation d'un transfert pipette en verre supprimer la PFA 4% / PBS et laver les embryons à deux reprises avec 1x PBST. Remplacer le 1x PBST avec 500 pi de HYB + et incuber les embryons pendant 4 heures à 70 ° C. NOTE: Pré-hybridation peut être réalisée pour aussi peu que 2 heures, 4 heures, mais est idéal. En outre, différentes températures d'hybridation et de lavage peut être idéal pour certaines sondes, comme 65 ° C, mais doivent être testés sur une base individuelle. Générer des ribosondes digoxygénine-marqué correspondant au gène (s) d'intérêt 41. Ajouter 16 mg de ribosonde à 16 ml de HYB +. Préchauffer la ribosonde / HYB solution à + 70 ° C pendant au moins 20 min avant de l'utiliser. Si vous utilisez plusieurs sondes, ajouter 16 pg de chaque sonde à la même HLe volume de + YB (16 ml). L'utilisation d'un transfert pipette en verre, enlever la HYB + et utiliser un P1000 à ajouter sur 200 pi de la ribosonde / HYB + mélange. Inverser la ribosonde / HYB + cocktail juste avant d'utiliser la pipette de haut en bas une fois avant d'ajouter le mélange dans chaque puits. Utilisez conseils barrière de pipette pour ajouter le ribosonde / HYB + solution, ce qui empêche la vapeur de mélange d'entrer dans la pipette. Incuber les embryons dans la ribosonde / HYB + cocktail à 70 ° CO / N. Utilisation d'un film adhésif pour couvrir les puits de la plaque pour le rapport O / N sonde incubation et tous les lavages suivants chaudes. Préparer 50% de formamide / 2x SSCT, 2x SSCT, et 0,2x SSCT et préchauffer à 70 ° CO / N. Utiliser un P1000, retirez la ribosonde / HYB + et stocker le mélange à -20 ° C. Eventuellement, re-utiliser la ribosonde / HYB + mélange jusqu'à trois fois. Avant chaque réutilisation, ajouter à 3 pg de la ribosonde d'origine riboprOBE / HYB + mélange. L'utilisation d'une pipette de transfert en verre, les embryons laver deux fois avec 50% de formamide / 2x SSCT pendant 30 min à 70 ° C. Laver les embryons une fois avec 2x SSCT pendant 15 min à 70 ° C. Laver les embryons à deux reprises avec 0,2 x SSCT pendant 30 min à 70 ° C. Retirez le SSCT de 0,2x et laver les embryons avec MABT deux fois à température ambiante. 10. Anti-digoxygénine Incubation de l'anticorps et détection Utiliser une pipette de transfert de verre pour éliminer la MABT de chaque puits. En utilisant une pipette de transfert en plastique, ajouter la solution de bloc fraîche dans chaque puits. Laissez les embryons incubent dans le bloc de 4 heures à température ambiante. Ajouter 8 ul d'anticorps anti-digoxygénine de 40 ml de solution de bloc (5000-dilution). En utilisant une pipette de transfert en plastique, remplacer la solution de bloc avec la solution d'anticorps / bloc. Ajouter suffisamment de solution d'anticorps / bloc pour couvrir complètement les embryons. Recouvrir la plaque de 48 puits avec du papier d'aluminium, de sorte qu'aucune lumière ne puisse pénétrer à travers les embryons. IncUbaté les embryons O / N à 4 ° C. En utilisant une pipette en verre, enlever la solution d'anticorps / bloc et laver les embryons 10 fois avec MABT pendant 5-10 minutes chaque. NOTE: Les lavages de MABT peuvent être effectuées en continu, car il faudra le chercheur 5-10 min pour éliminer MABT de chaque plaque et passer MABT frais dans les puits. Générer deux tubes de 40 ml (80 ml au total) de mémoire tampon de pré-coloration. Ajouter 180 ul de NBT (50 mg / ml) et 140 ul de BCIP (50 mg / ml) à l'un des tubes préparés de tampon de pré-coloration pour créer la solution de coloration. REMARQUE: Cette solution de coloration va générer un substrat de couleur pourpre. Remplacer le MABT avec mémoire tampon de pré-coloration et laisser les embryons incuber à température ambiante pendant 5 min. Remplacer le tampon de pré-coloration avec la solution de coloration et laisser à température ambiante. Surveiller la réaction colorimétrique toutes les 15 minutes en utilisant un microscope stéréoscopique. NOTE: réactions coloration peut prendre de quelques minutes à plusieurs heures en fonction de la sonde. Repsdentelle la solution de coloration avec 1x PBST après la réaction de coloration est terminée, puis laver les embryons à deux reprises avec 1x PBST pendant 5 min. Retirez le 1x PBST et ajouter 4% PFA / PBS à fixer les embryons. REMARQUE: Vous pouvez également effectuer un double souhaite détecter ribosondes marquées avec un anticorps anti-fluorescéine. Si vous effectuez une double in situ, passez ajoutant 4% PFA / PBS (Étape 10.9) après le 1x PBST lavage (Étape 10.8) et laver les embryons deux fois pendant 15 min avec 0,1 M de glycérol, deux fois pendant 15 minutes avec des lavages de MABT, puis incuber les embryons pendant 30 min dans le bloc. Puis ajouter l'anticorps correct O / N et effectuez les étapes de 10.03 à 10.09 en utilisant la solution de coloration correcte. Pour détecter la ribosonde marqué à la fluorescéine, préparer une solution de coloration avec BCIP et INT à observer un substrat rouge (voir l'étape 10.1). 11. notation l'écran chimique embryons plaques Effectuer notation visuelle des résultats en utilisant un microscope stéréoscopique pour évaluer la sampl d'embryonses dans l'essai de phénotype. En utilisant une pipette de transfert en plastique, transférer les embryons à partir des plaques de 48 puits à plaques à 12 puits pour une visualisation optimale. Etiqueter les plaques à 12 puits afin qu'ils correspondent aux emplacements des puits de la plaque de 96 puits profond d'origine. Lorsque le transfert est terminé, voir sous la loupe binoculaire. REMARQUE: les embryons représentatifs peuvent être choisis parmi plaques à 12 puits et reproduit sur ​​des lames de verre sous une lamelle 41.

Representative Results

L'approche manuelle décrite ici permet pour un seul chercheur pour mener efficacement et avec succès un haut débit de petites molécules chimiques génétique de l'écran en utilisant le modèle de embryon de poisson zèbre (figure 1). En utilisant cette méthode, il est pratique pour une personne seule à effectuer un écran génétique chimique, tels que, au cours de 9 semaines une personne (commis à une semaine de travail de 40 heures) peut effectuer une enquête de ~ 600 composés (Figure 1) . Ainsi, le temps de banc d'une personne peut contourner la nécessité d'une haute ressource équipement exigeant, systèmes automatisés tels. Le compromis est que un écran manuel nécessite plusieurs semaines d'effort dédié. En revanche, l'utilisation de systèmes automatisés peuvent réduire le temps impliqué dans 1-2 semaines de robotique, et peut comporter des efforts de chercheur relativement minime globale. Une façon d'augmenter l'efficacité et / ou la portée d'un écran manuel est d'enrôler 2-3 chercheurs au total, ce qui permettrait le dépistage de mcomposés de minerai, variant la concentration du composé, et / ou de dépistage sur une période de temps plus courte. Les principales étapes dans le protocole de remplir un écran génétique chimique dans embryons de poisson zèbre avec un souhait lecture sont illustrés sous forme d'organigramme (Figure 2). Les tâches expérimentales peuvent être divisés en deux types de semaines de travail: (1) l'exposition chimique et d'étiquetage de l'embryon, et (2) l'analyse et d'imagerie. Dans la semaine de travail de l'exposition chimique, ces mesures comprennent la mise en place des adultes de poisson zèbre (Jour 1), la collecte des embryons, des embryons de formation de réseau et traitement de la toxicomanie (Jour 2), la préparation d'embryons pour l'hybridation in situ (Jour 3), et l'hybridation in situ (Jour 4 -6). Dans la semaine qui analyse / d'imagerie, le chercheur analyse l'expression de l'ARNm de marquer les embryons et les coups de l'image (Jour 7-11). Une partie essentielle de l'exécution d'un écran génétique chimique est à étiqueter systématiquement et avec précision les emplacements de puits. Comme l'écran génétique chimique pPROCESSUS détaillé ici implique le transfert des ensembles d'embryons d'un puits dans une plaque à un puits dans une plaque différente à plusieurs reprises, la nécessité d'un étiquetage clair et précis est primordiale, de sorte que quand un coup chimique est marqué, il peut être linéaire et facilement remonter son identité à l'intérieur de la bibliothèque chimique (figure 3). Un moyen facile d'y parvenir est d'étiqueter les plaques de manière à ce que à tout moment l'emplacement du puits pour un ensemble d'embryons traités par un composé correspond directement l'emplacement du puits chimique bibliothèque de plaque de la drogue du composé utilisé pour traiter les embryons (Figure 3). Ici, un double système de codage couleur et numériques d'étiquettes est utilisé pour organiser les échantillons, qui ont été ajoutés aux plaques d'écran à l'aide de marqueurs permanents (figure 3). En analysant les résultats d'un écran à haut débit, il est absolument nécessaire de développer une méthode pour organiser correctement, annoter et analyser potentiel petite moléculecoups. Par conséquent, un écran génétique chimique doit avoir un système de classement complet et clair qui est soigneusement conçu et strictement respectée. Un tel système devrait facilement et complètement transmettre les dynamiques importantes d'un composé et fournir de façon concise à présenter les résultats de l'écran fini. Une façon de construire un tel système est d'embryons de qualité en utilisant un système de classe, ce qui expliquerait la sévérité morphologique globale et la confiance d'un coup. En outre, les catégories de classe pourrait être couplé avec un (+) ou (-) pour décrire soit un effet expansif ou réductrice sur la région (s) d'intérêt. Ici, les embryons de poisson zèbre ont été soumis à des composés individuels à partir d'une bibliothèque bioactif (Enzo Chemicals) de 50% à 24 épibolie HPF, puis dosés par WISH l'aide d'un cocktail de trois ribosondes pour détecter des segments du néphron (Figure 4A). Comme un système de classement par exemple, un puits qui contient un groupe d'embryons qui ont eu un convolu proximale considérablement élargieTed tubule (PCT) des pronephros, le rein embryonnaire du poisson zèbre, causerait le composé utilisé pour traiter que le bien-être catégorisés comme (classe I), qui dans ce cas serait de représenter la classe associée au défaut le plus grave et le plus haut niveau de la confiance dans le phénotype observé (figure 4B). Le composé alors être annotée avec (PCT) et un (+), la notation complète étant (Classe I – PCT +) (figure 4B). Ce concept de classification fournit un moyen simple et rapide pour décrire une mine d'informations concernant une petite molécule d'intérêt, notamment la gravité de l'effet des composés sur l'organisme, la région qui est affectée par le médicament et la façon dont la région est affecté (figure 4B). Figure 1. & #160;. Le poisson zèbre stratégie de l'écran embryon chimique Manuel Un chercheur peut réalistement tester une plaque de 96 puits de produits chimiques sur les embryons de poisson zèbre et effectuer un traitement ultérieur WISH au cours d'une seule semaine. Exécution de deux semaines de tests chimiques (Semaine 1 (Jour 1-6) et la semaine 2 (7-12 jours)) peut être couplé avec un troisième semaine dédiée à l'analyse de l'échantillon. Environ deux plaques 96 et une valeur d'échantillons de l'écran peuvent être marqués et imagés Semaine 3 (Jour 13-17). Ce scénario représente le criblage d'environ 200 composés dans un laps de temps de 3 semaines, ce qui correspond à une petite bibliothèque d'environ 600 composés complètement filtrés par 9 semaines. Cette stratégie manuelle peut être modifiée en fonction des ressources disponibles. Par exemple, trois chercheurs peuvent réduire le temps de remplir un écran d'environ 600 composés à trois semaines par rapport aux 9 semaines, il prendrait avec un chercheur. Les stratégies de dépistage peuvent être adaptés en attribuant des chercheurs à des aspects spécifiques de l'écran, comme médicament régalment et l'hybridation in situ ou dirigeant les chercheurs pour effectuer indépendamment du processus de contrôle sur des parties distinctes de la bibliothèque chimique. Figure 2. Organigramme:. Panne de six jours workflow écran Le processus de criblage chimique peut être discrètement décomposé en 6 jours. Jour 1 consiste à créer des paires poisson zèbre d'accouplement (= /> 25) pour fournir des embryons pour chaque plaque de 96 puits à cribler. Jour 2 implique la collecte d'embryons à partir des chambres d'accouplement et les rangeant dans un plaque de 96 puits profond, suivi par un traitement médicamenteux. Le Jour 3, les embryons sont prêts pour WISH, y compris dechorionation, la fixation des tissus, et l'embryon déshydratation. Enfin, WISH est effectué sur les embryons par jour 4-6. Se il vous plaît noter que les procédures de coloration alternatives sur des échantillons fixés peuvent être facilement substituted pour WISH. Figure 3. Plate étiquetage de transfert schématique. Embryons de poisson zèbre sont disposés et traités par le médicament dans une plaque de 96 puits a ensuite déménagé à une plaque de 24 puits pour l'enlèvement des débris et de l'exposition pronase. Les embryons sont ensuite déplacés à plaques à 48 puits pour la préparation de l'embryon, souhait, et la fixation des tissus. Ensuite, les embryons sont transférés dans des plaques de 12 puits pour le ballon, l'imagerie et le stockage. Formation de réseaux précis d'embryons est réalisé par l'utilisation d'un système de codage couleur qui permet au chercheur de garder une trace de la substance chimique d'origine pour chaque échantillon de test. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" fo:coMÉNAGEMENT-width = "5 pouces" src = "/ files / ftp_upload / 52063 / 52063fig4highres.jpg" width = "500" /> Figure système de notation 4. Exemple:. Essai de segmentation du rein Une expérience WISH permet au chercheur de teinture des types de cellules spécifiques sur la base de l'identité des sondes qui sont sélectionnés, ce qui permet l'évaluation de l'évolution de phénotypes d'embryons selon les changements de localisation de l'ARNm de transcription et / ou niveaux. A titre d'exemple, trois segments de rein embryonnaire du poisson zèbre, les pronephros, ont été marquées en utilisant l'écran 1. Ecran Mix Mix 1 est un cocktail de sondes comprenant des wt1b, qui se localise spécifiquement dans les podocytes (P), qui marque la slc20a1a contourné proximal tubule (PCT), et slc12a1 qui marque le début distale (DE) secteur 47. Un symbole (+) à côté d'une étiquette de région est utilisé pour annoter l'expansion ou changement positif de cette région, tout un symbole (-) est utilisé pour dicter la diminution d'une région. Ici, embryons drogue traitée avec 13-cis RA ont un tubule contourné proximal élargie et une perte complète du segment début distale avec aucun effet apparent sur ​​les podocytes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Génétique chimiques dans le poisson-zèbre peuvent avoir un impact critique sur la progression de la découverte de médicaments. Ce protocole fournit une méthode manuelle à haut débit pour effectuer la génétique chimique dans embryons de poisson zèbre avec un désir de lecture, permettant effectivement une équipe ou un petit de procéder à un petit écran de molécule. Cette méthode minimal des ressources étend la faisabilité de la génétique chimique à de nombreux groupes de recherche. Plus précisément, cette stratégie de l'écran offre une alternative importante à l'utilisation des instruments robotisés, de tels systèmes ne sont pas largement accessible à travers les départements de recherche. Cet écran permet à un seul manuel individuel pour tester une plaque de 96 puits de composés avec une lecture de WISH dans une semaine de travail de 6 jours. Depuis poisson zèbre sont ovipares, les embryons en développement en dehors de la mère, et les embryons sont assez grands pour voir à l'oeil nu (entre 1-3 mm), ils se prêtent à la manutention manuelle avec des instruments simples et le chercheur peut échantillons du tableau dansplaques multi-puits sans l'utilisation d'un microscope. En outre, étant donné que le poisson-zèbre développer rapidement, petite molécule exposition peut être efficace avec un seul traitement d'un composé, plutôt que des doses répétées, ce qui réduit en outre le traitement manuel. Embryons de poisson zèbre sont faciles à cultiver parce que leur jaune constitue une source de nutrition jusqu'à 5-6 jours après la fécondation, ce qui élimine la complication des alevins d'alimentation. En outre, la majorité des organes larvaires ont développé et devenir fonctionnel au cours de cette période, ce qui fournit l'occasion d'étudier un large éventail de questions de recherche. La simple addition de petites molécules aux médias embryon d'incubation est non-invasive et permet au chercheur (s) pour sélectionner pour la dose de médicament, moment de l'addition, et la durée de l'exposition ainsi fournir un contrôle serré sur de nombreuses variables et qui permettent au processus de développement spécifiques d'intérêt à être interrogé. Comme décrit ici, la productivité de recherche important peut être réalisé en un court timeframe en utilisant cette méthode manuelle de l'écran. Dans notre expérience, il ya un retour sur l'effort investi, ce qui peut être accentué en utilisant une bibliothèque chimique bioactive connu pour analyser un processus d'intérêt, tels que la segmentation des néphrons au cours du développement rénal (Figure 4; Poureetezadi et Wingert, non publié).

L'écran chimique manuel décrit ici est exceptionnellement polyvalent car il implique une analyse sur des échantillons de poisson zèbre fixes. Par exemple, cette stratégie peut être révisé à tester plusieurs plaques de composés dans une semaine, puis de marquer embryons la semaine suivante. Tests alternatifs sur des échantillons de poisson zèbre fixes, tels que l'immunohistochimie ou autre coloration des tissus préparations, pourraient également se substituer à la WISH lecture. Stratégies expérimentales pour réaliser des tests cellulaires chez le poisson zèbre sont adaptables en raison de la clarté optique et la transparence des premiers stades de développement. En outre, les chercheurs peuvent inhiber la pigmentation au plus tard stages utilisation de produits chimiques ou d'éviter la complication de développement de pigment totalement par l'utilisation de lignées génétiques pigments ou moins comme Casper pur poisson zèbre ^13. Il est possible d'administrer manuellement de petites molécules, de traiter la tache (s) d'intérêt, et de marquer manuellement embryons en utilisant un microscope stéréoscopique simple. Cependant, il est important de garder à l'esprit que l'analyse automatique de l'image pourrait être effectuée, et peut en fait être nécessaires pour l'analyse du phénotype de haute résolution. Par exemple, il peut être préférable de partenaire un système d'analyse d'image automatisée avec un dosage direct, comme un journaliste transgéniques, comme ce rationalise le traitement manuel des échantillons, quantifie les différences difficilement perceptibles à l'œil nu, et élimine les préjugés du chercheur ^15. Heureusement, certains systèmes d'imagerie automatisés sont à la fois économique et en termes de coûts de logiciels ¹⁵ convivial. L'utilisation et les capacités des autres systèmes automatisés ont rapidement évolué et peutêtre utilisé pour orienter les organismes, administrer des traitements médicamenteux, et même de déménager organismes ^12,15. Ces systèmes automatisés ont annoncé une nouvelle ère technologique de la recherche et ont fourni des solutions innovantes pour manipuler de grandes quantités de sujets de test et ainsi effectuer HTS et HCS approches dans des organismes entiers ^12,15. Bien que ces machines sont indéniablement des outils utiles, ils sont aussi très coûteux et sont hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche fondamentale. Sans accès à ces fonctionnalités automatisées, il peut sembler que les écrans chimiques ne sont pas possibles. Toutefois, ce protocole présente un guide pour savoir comment procéder à un écran manuel qui peut être utilisé pour compléter un écran génétique chimique d'une manière pratique sur une période de temps raisonnable.

Des inconvénients tant pour le dépistage et chimiques génétique manuels en général existent, et doivent être gardés à l'esprit lorsque l'on considère un écran chimique. En particulier, la méthode illustrée ici nécessite un degré modérédextérité physique. Cette préoccupation est réduite ou entièrement évité par la répétition, comme la dextérité sera améliorer avec la pratique. En outre, il ya place pour un minimum d'erreur grossière, car il ya seulement 10 embryons par puits pour l'analyse. Les petites molécules peuvent varier dans la pénétrance du phénotype qui est induite, si un régime raisonnable de marquer à identifier des composés d'intérêt doivent être respectées. Il est essentiel que les chercheurs utilisant ce protocole élaborer des critères suffisamment rigoureuses pour ce qu'ils vont envisager un succès. Il est également important de garder à l'esprit que la nature de cette forme de l'écran sera très probablement donner une certaine portion de faux positifs, qui peuvent être délimités par chimique autre traitement. En outre, il est essentiel de mettre en scène des embryons précisément et de recueillir embrayages pour le dépistage peu de temps après la fécondation, le développement asynchrone peut entraîner des complications à évaluer avec précision l'effet des traitements médicamenteux. En outre, en ce qui concerne le dépistage chimique comme un exstratégie expérimentale, il existe une multitude de limitations. Solubilité composé et la toxicité des molécules porteuses (par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO)) peuvent également présenter un problème et peuvent être prohibitifs pour tester de nombreuses molécules. Le chorion peut aussi agir comme barrière à l'exposition au médicament. Enfin, même si le poisson zèbre constituent un modèle puissant et translationnelle pour la génétique chimiques, il faut toujours être prise pour déterminer si une stratégie d'écran chimique de remplacement, par exemple, en utilisant un système in vitro comme une lignée cellulaire, peut être remplacé par l'utilisation de l'ensemble de les animaux. Néanmoins, le traitement chimique dans l'ensemble du système poisson-zèbre est jugé préférable de faire des approches similaires chez les mammifères, car il offre l'avantage de rassembler les effets systémiques des composés et peut permettre aux chercheurs de trier la liste des composés à tester dans un modèle mammifère.

À ce jour, les écrans chimiques du poisson zèbre ont fourni un puissant outil expérimental to définir les mécanismes de développement et de déterminer les agents pharmacologiques candidats pour une utilisation en médecine, tel que l'identification de molécules capables de prévenir les pathologies de la maladie. Par exemple, une étude de Burns et ses collègues ont développé un essai micro-puits automatisé de rythme cardiaque en utilisant embryons de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP dans le myocarde ^42. Ils ont utilisé cette lignée transgénique pour analyser la fréquence cardiaque dans le développement et la façon dont il a été affecté à un traitement médicamenteux ^42. Une autre étude, en testant la densité de population de cellules souches hématopoïétiques dans l'embryon de poisson zèbre, a révélé que la prostaglandine E2 régule la niche HSC ^23. Ce constat a été validé chez la souris, et a ensuite été mis en œuvre pour les essais cliniques dans les greffes de cordon ombilical humain ^23,31-33 (NIH, clinique Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Grâce à plusieurs études récentes, la génétique chimique a prouvé pour être utile dans l'étude de la maladie du rein en utilisant le poisson zèbre <sjusqu'à> 43. Le rein poisson zèbre est un excellent paradigme pour étudier néphrogenèse ou régénération du néphron, l'unité fonctionnelle qui composent le rein au cours du développement et l'insuffisance rénale aiguë blessures ^43. la structure des néphrons est hautement conservée entre le poisson zèbre de rein embryonnaire et adulte des reins de mammifères ^44-50. Plusieurs études portant sur le rein embryonnaire du poisson zèbre illustrent clairement le potentiel de translation inhérente lorsqu'il est couplé avec la génétique chimiques. Un écran génétique chimique a été réalisée sur deux mutants de poisson zèbre qui ont été cartographiés à l'gènes PKD2 et ift172, qui sont connus pour être des acteurs clés dans la polykystose rénale (PKD) ^34. L'écran a abouti à l'identification de la déacétylase pan-histone (HDAC) trichostatine A (TSA) comme une petite molécule qui pourrait annuler les défauts morphologiques normalement observés dans les embryons mutants. Une approche différente adoptée par de Groh et collègues dépistage de composés qui INDUCed œdème de type sauvage embryons de poisson zèbre, ce qui indiquerait une perturbation de la fonction rénale ^35. Après avoir identifié PTBA comme un succès, ils ont observé que, en plus de provoquer un oedème, PTBA également augmenté l'expression de pax2a, un marqueur pour les progéniteurs du rein. Surtout, un dérivé optimisé de PTBA a ensuite été montré pour diminuer la mortalité pour cent de poisson zèbre adulte qui a subi des dommages aux reins de la gentamicine et de plus, accélère la récupération des souris qui ont souffert de lésions rénales ^27. Pris ensemble, ces contributions de la génétique chimiques de poisson zèbre présentent les types de découvertes qui peuvent être faites selon la méthode décrite dans ce protocole.

Alors que la recherche en génétique chimiques porte mérite considérable, il ne va pas sans certaines difficultés. Uniquement en utilisant une approche génétique chimique peut le rendre complexe à déterminer le ou les gènes spécifiques qui sont affectées par un composé. Même si une cible (s) est détectée, si ungnificant écart peut rester entre l'identification des composés et la compréhension du mécanisme (s) d'action dans lequel la petite molécule se comporte. Par exemple, il peut être difficile de déterminer le mécanisme par lequel une petite molécule agit en raison d'un seul composé est capable d'avoir une série d'effets différents au sein d'un organisme. Cependant, avec l'avènement des nouvelles technologies et plusieurs écrans génétiques chimiques en cours d'achèvement chez le poisson zèbre, le problème de la détermination d'un mécanisme est en baisse. Une méthode pour aider à déterminer les effets moléculaires des composés identifiés est de sélectionner une bibliothèque de médicaments de composés bioactifs connus pour le dépistage, où les mécanismes peuvent être potentiellement déduites des données déjà annotées. En outre, les algorithmes chemoinformatic, comme porte Discovery, sont disponibles pour l'utilisation qui peut comparer les similitudes structurelles d'un composé contre une base de données de composés avec des mécanismes attribuées ^14. Encore une autre manière à élucider le mécanisme d'un composé consisterait à générer une microarray profil après le traitement, puis interroger ce profil dans une compilation de profils pharmaceutiques des puces à ADN, comme Carte de la connectivité, la recherche de composés mécaniquement définies qui provoquent un effet similaire ^14. Cette approche peut également être utilisée pour identifier des mutants génétiques qui ont un effet similaire à celui du composé d'intérêt. Recherche d'une connexion entre un composé et un mutant pourrait suggérer que le composé moléculaire travaille en amont ou en aval du gène est associée, qui peut être délimitée par traitement des mutants avec le composé et morpholinos. Une autre option serait la spectrométrie de masse, qui continue à devenir plus optimisé pour le poisson-zèbre. Cette méthode peut être utilisée pour délimiter les modifications de protéines spécifiques ou de modifications post-traductionnelles après le traitement médicamenteux. Enfin, les petites molécules ou même des bibliothèques entières sont parfois capable d'être marquée pour déroulant de partenaires de liaison. Il est également intéressant de noter que, bien que le mécanisme de comment un petit fonctions de molécules is d'importance majeure, il existe des médicaments approuvés par la FDA pour qui les mécanismes restent inconnus.

Bien que le poisson zèbre présentent de nombreuses similitudes avec les mammifères à la fois génétiquement et physiologiquement, il ya encore un problème de drogue croisement ^14. Une étude a examiné la capacité de croisement des résultats à partir d'un écran d'inhibiteurs du cycle cellulaire dans ⁵⁰ embryons de poisson zèbre. L'écran a abouti à l'identification de 14 résultats qui étaient auparavant inconnu posséder une activité du cycle cellulaire. Sur ces 14 composés, 6 ont été révélés avoir une activité du cycle cellulaire dans les deux essais de culture de cellules humaines et de poisson zèbre, 3 ont été montré pour être sérum inactivé dans des essais de culture de cellules, 1 est actif uniquement dans les cellules de poisson zèbre, et 4 eu aucune activité dans les deux le poisson-zèbre ou des dosages de culture de cellules humaines, mais seulement dans l'ensemble de l'organisme du poisson zèbre. Notamment, les 4 composés que seulement avaient une activité dans le poisson-zèbre montrent qu'il existe des différences entre le poisson zèbre et les mammifères qui peuvent Matières interditesbit le potentiel de translation de certains composés. Ceci est une considération importante à garder à l'esprit, cependant, il existe des exemples de petites molécules, comme PGE ₂ qui amplifie la capacité des CSH à greffer des receveurs humains et PtBA dérivés qui améliorent le taux de récupération rénale chez les mammifères, fournissant ainsi la preuve de principe qui croisement est possible ^23,31-33.

Indépendamment de ces écueils, la génétique chimique et cette approche minimale des ressources a beaucoup à offrir à la communauté de recherche. Génétique chimique est particulièrement utile dans le poisson-zèbre et continueront à jouer un rôle crucial dans les interrogatoires de la voie moléculaire et la découverte de médicaments. écrans chimiques à base de cibles moléculaires discrètes ont toujours été soumis à un taux d'échec élevé en raison de ce qui est connu comme la constellation d'adsorption, distribution, métabolisme, excrétion, et toxicologiques (ADMET) propriétés ^51. Écrans chimiques en utilisant le poisson zèbre pourmettre l'accent sur un processus, plutôt que d'une cible discrète, peut contourner plusieurs problèmes ADMET et identifier des composés qui sont efficaces dans le contexte de l'ensemble de l'organisme. Avec la piscine de plus en plus de ressources disponibles pour la recherche du poisson zèbre, y compris des souches mutantes actuelles et la possibilité d'utiliser l'édition du génome à créer des mutants et transgéniques génétiques ciblées, il n'y a pratiquement un nombre illimité d'écrans génétiques chimiques potentiels en utilisant le poisson zèbre. Beaucoup de bibliothèques chimiques ont été organisée, et des collections de portée avec bioactifs connus, de nouveaux composés, de structures diverses et structurellement similaires. Ces réactifs offrent une multitude de possibilités intéressantes pour les combinaisons d'écrans qui sont actuellement disponibles et sont susceptibles de se développer dans les années à venir. Avec ces possibilités à la main, ce protocole manuel et à haut débit offre un moyen pratique et facile à utiliser pour augmenter la capacité des groupes de recherche à entreprendre écrans génétiques chimiques en utilisant le poisson zèbre.

Materials

JoVE 51922 MATERIALS
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.1 – 10 υL natural pipet tips	USA Scientific	1111-3800
1 X E3	N/A	N/A	Generate using 50X E3 and DI water.
1 X Pbst	N/A	N/A	Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs.
10X Pbs	American Bioanalytical	AB11072
12-well staining dish	BD-Falcon	35-3225
20X SSC	American Bioanalytical	AB13156
24 well plate	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1X Pbs	N/A	N/A	Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C.
48 well plate	CytoOne	CC7672-7548
50 X E3	N/A	N/A	Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water.
96 deep well plate	VWR	100-11-940
96 well plate sealing mat	VWR	10011-946
anti-digoxigenin antibody	Roche	11-093-274-910	Keep at -20 °C.
anti-fluorescein antibody	Roche	11-426-338-910	Keep at -20 °C.
BCIP stock	Sigma	B8503	Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C.
block solution	N/A	N/A	Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.)
BSA (bovine serum albumin) stock	American Bioanalytical	AB00448	Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.)
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents	Roche	11175025910; 11685619910	Consult the manufacturer procedure.
DMF (dimethylformaldehyde)	American Bioanalytical	AB00450
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer	Roche	4716728001
embryo incubation dish	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 υL	Eppendorf	22492284
Ethanol (EtOH)	Sigma	E7023	Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C.
FCS (fetal calf serum) stock	Invitrogen	16140089	Keep at -20 °C.
filter sterilization unit	Corning	430516	0.45 υm CA / 1L volume
fine forceps	Roboz	RS-1050
flat-bottom microcentrifuge tube	VWR	87003-300; 87003-298
Formamide	American Bioanalytical	AB00600	Keep at -20 °C.
glass basin 90 x 50	Kimax Kimble	23000
glass pipette	VWR	14673-010
glass vial	Wheaton	225012
glycerol	Sigma	G7893
glycine	Sigma	G8898
glycogen	Roche	10901393001
HYB+			Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin
INT stock	Sigma	I8377	Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C.
MAB			Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave.
MABT	N/A	N/A	Generate 0.1% Tween-20 in MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
mesh tea strainer	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
molecular grade distilled water	Mediatech	25-055-CM
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL	Eppendorf	3122000.019
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stock	Sigma	N6876	Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C.
paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	19210
PCR-Film adhesive	Eppendorf	30127.48
plate container (Pencil Box)	Sterilite	1722
pre-staining  buffer	N/A	N/A	Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)
Pronase	Roche	11459643001	Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C.
Proteinase K	Roche	03-115-879-001	Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C.
RNase 1 inhibitor	Roche	3335399001
rubber bulb	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
small plastic Petri dish	Corning	430589, 430588
SP6 RNA polymerase	Roche	11487671001
staining solution-purple	N/A	N/A	Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.
staining solution-red	N/A	N/A	Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.
stereomicroscope	Nikon	SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polymerase	Roche	11031171001
T7 RNA polymerase	Roche	10881775001
transfer pipet	Samco	202, 204
Tween-20 stock	American Bioanalytical	AB02038
waterbath	Thermo	51221073	(Model # 2831)