Der Zebrafisch ist eine hervorragende experimentelle Organismus auf wirbelEntwicklungsProzesse und das Modell menschlichen Krankheit zu studieren. Hier ein Protokoll auf, wie man eine manuelle chemische Bildschirm mit hohem Durchsatz in Zebrafischembryonen mit einer führen beschreiben wir ganze-mount in situ Hybridisierung (WISH) ausgelesen.
Zebrafische haben sich zu einem weit verbreiteten Modellorganismus, um die Mechanismen, die Entwicklungsbiologie zugrunde zu untersuchen und menschlichen Krankheitspathologie studieren aufgrund ihrer beträchtlichen Grad an genetischer Erhaltung mit Menschen. Chemische Genetik bringt Testen der Wirkung, dass kleine Moleküle auf einem biologischen Prozess und ist immer eine beliebte Methode, um translationale Forschung therapeutische Verbindungen zu identifizieren. Zebrafische sind speziell attraktiv für für chemische Genetik wegen ihrer Fähigkeit, große Klauen transparent Embryonen, die extern befruchtet werden zu produzieren verwenden. Weiterhin können Zebrafischembryonen leicht Medikament durch die einfache Zugabe einer Verbindung zum Embryo Medien behandelt werden. Verwendung von Vollmontage in situ Hybridisierung (WISH), kann die mRNA-Expression eindeutig in Zebrafischembryonen visualisiert werden. Gemeinsam mit chemischen Genetik und wünschen, wird der Zebrafisch ein potenter gesamten Organismus Kontext, in dem zur Bestimmung der zellulären und physiologischenAuswirkungen von kleinen Molekülen. Innovative Fortschritte bei Technologien, die computerbasierte Screening-Verfahren zu nutzen gemacht, aber für viele Labors solche Optionen nicht zugänglich sind oder bleiben aus Kostengründen. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie Sie ein manuelles Hochdurchsatz-chemisch-genetischen Bildschirm, der grundlegenden Ressourcen erfordert und von einer einzelnen Person oder einer kleinen Gruppe in einem effizienten Zeitperiode erreicht werden auszuführen. Somit stellt dieses Protokoll eine machbare Strategie, die von Forschungsgruppen implementiert werden, um chemische Genetik im Zebrafisch durchzuführen, die nützlich für die Gewinnung grundlegender Einblicke in Entwicklungsprozesse, Krankheitsmechanismen sein können, und neue Verbindungen und Signalwege, die medizinisch relevanten Anwendungen zu identifizieren .
Die Identifizierung von wirksamen therapeutischen Medikamenten für die menschliche Krankheit zu behandeln, ist das Endspiel für viele biomedizinische Forscher. Während die Identifizierung und Charakterisierung von potenziellen pharmakologischen Wirkstoffen für klinische Anwendungen hat offensichtliche Wert für das Gesundheitswesen, hat es eine große Herausforderung geblieben. Letztlich ist die Entwicklung von vielen therapeutischen Verbindungen kommt aus dem Wissen über spezifische Zelltypen entweder entwickeln oder Funktion. Der Zebrafisch, Danio rerio, ein Süßwasser Teleost der Cyprinidae Familie, die sich zu einem Mainstream-Modellorganismus in der Entwicklungsbiologie 1 hat. Zebrafische sind genetisch manipulierbaren Wirbeltiere, die leicht für wissenschaftliche Studien 2,3 zu erhalten und zu manipulieren sind. Die Zebrafischembryo ist transparent, extern befruchtet und können durch die Hunderte von einem einzigen erwachsenen Paarung Paar in nur einer Woche 2,3 hergestellt werden. Außerdem Zebrafisch Aktien wichtige Organsysteme und besitzen eine große degree der genetischen Ähnlichkeit mit Säugetieren, einschließlich Menschen 4. Auffallend ist, dass 70% der menschlichen Gene haben einen Zebrafisch Ortholog 4. Aufgrund dieser Ähnlichkeit haben Zebrafisch ein sehr relevant Versuchssystem für die Untersuchung der Mechanismen der Entwicklung von Wirbeltieren und Physiologie und verwendet worden, um eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen 5-7 zu wiederholen. Diese Gründe, unter anderem haben die Zebrafisch ein idealer Kandidat für die Fortsetzung genetische Vernehmungen gemacht und in einer stetig wachsenden Wertschätzung für die Nützlichkeit der Zebrafisch in der biomedizinischen Forschung 6,7 geführt.
Im Laufe der letzten Jahrzehnte haben eine Fülle von genetischen Werkzeugen im Zebrafisch entwickelt. Der Zebrafisch Genom zugänglich Mutagenese und Transgenese 3. Bisher eine Vielzahl von Vorwärts- und Rückwärts genetische Studien wurden durchgeführt, was zu der Erzeugung von mehr als 9.000 Mutanten 3. Außerdem haben zahlreiche transgenen Linienen erstellt, die bei der Kennzeichnung und Isolierung von spezifischen Zelltypen 3 aktiviert haben. Es gab signifikante laufenden Bemühungen zu zentralisieren und zu verteilen, diese Ressourcen für die Forschung, die auf einem relativ niedrigen Kosten durch den Zebrafisch Internationale Resource Center (ZIRC) 8 für Laboratorien zugänglich sind. Ferner ist eine umfangreiche Sammlung von biologischen Informationen und molekulare Werkzeuge, angefangen von Genexpressionsmustern, Sequenzen und Protokolle Morpholino, wurden schrittweise auf dem Zebrafisch Information Network (ZFIN) 9-11 annotiert. Diese Zebrafisch Forschungsinfrastrukturen sind durch erhebliche NIH Unterstützung und Interessenvertretung dieses Tiermodells 8 ermöglicht. Dieser Cache von Zebrafisch-Mutanten, transgenen Linien und relevante Informationen weiterhin von außergewöhnlichem Wert auf die biologische Forschung Gemeinschaft zu groß sein. Doch während Zebrafisch sind jetzt eine gut etablierte und herausragende Modellorganismus, sie a la darstellenrgely ungenutztes Reservoir zur Entwicklungsbiologie und Krankheit durch den Einsatz von chemisch-genetischen Bildschirme zu studieren.
Chemische Genetik ist die Verwendung von kleinen Molekülen, wie beispielsweise Arzneimittel oder andere Verbindungen, um einen biologischen Prozess in einem lebenden System 12 beeinflussen. Chemische Genetik kann implementiert werden, um die molekularen Mechanismen der Gen-Funktion zu verstehen, wie Agenten zu identifizieren, dass die Rettungs oder verstärken einen bestimmten genetischen Defekt 12 werden. Ferner stellt chemische Genetik eine große Allee, um translationale Forschung 12 durchzuführen. Während traditionelle Vorwärts genetischen Screens in Tiermodellen haben enorm mächtig in Verknüpfung spezifischer Gene für Krankheiten gewesen, fehlt ihnen eine zeitliche Dimension, so dass es schwierig oder manchmal unmöglich, Phänotypen, die nach der frühen Embryogenese entstehen würden beobachten. Zusätzlich kann Gen Redundanz machen die aus Termin Genetik beobachteten Ergebnisse schwer zu interpretieren. Alternativ chemische genetischen Screensermöglichen feine zeitliche Kontrolle und gleichzeitig ein wertvoller Ausgangspunkt für die Wirkstoffforschung 12,13.
Chemische Genetik können mit in vitro-Systemen (zB Zelllinien, Proteine), oder unter Verwendung eines in vivo-System, wie einem ganzen Organismus durchgeführt werden. Verwendung eines in vitro-System für die chemische Genetik kann vorteilhaft sein, weil es einfacher ist, als eine ganze Organismus System leichter arbeiten mit großem Maßstab, weniger kostspielig und weniger zeitintensiv. Als Ergebnis ermöglicht in vitro-Systeme für sowohl Hochdurchsatzscreening (HTS) und High-Content-Screening (HCS). Es gibt eine Reihe von Vorteilen für die Verwendung eines in vitro-System, das betrachtet werden soll, wenn Annäherung chemische Genetik, sondern auch erhebliche Einschränkungen. Eine große Einschränkung der Verwendung einer Zelllinie ist, dass kleine Moleküle wirksam und nicht toxisch in einer bestimmten Zelllinie sein, dennoch toxisch, wenn sie in einem ganzen Organismus ein. Damit ist der springende Punktder Punkt ist, dass in vitro-Systemen nicht die breiten Kontext eines Organismus zu erfassen und sind daher nicht immer in der Lage, genau zu imitieren, was in einem ganzen Organismus passiert. Während Testverbindung in ganzen Organismen können diese Probleme zu umgehen, ist die Verwendung von Säugetier gesamten Organismus Modelle stellt eine Anzahl von physikalischen und ethischen Einschränkungen. Beispielsweise Arzneimittel-Screening in Maus logistisch durch den Raum und Kosten benötigt, um eine ausreichende Stichprobengröße testen behindert. Außerdem kann der Entwicklungs Fragen schwer zu studieren, aufgrund der Tatsache, dass Säugetiere in utero entwickeln. Schließlich, während das Verhalten der biomedizinischen Forschung hat immense gesellschaftliche Bedeutung, gibt es doch erhebliche Anforderungen an den Tierschutz durch Begrenzung intensiven Studien und Linderung der Schmerzen und Leiden der Tiere für die Forschung verwendet zu schützen. Zebrafisch eine tragfähige Ersatz für die Arbeit mit höheren Wirbeltiere wie Säugetiere, und darüber hinaus können viele Themen mit chemischen Genetik an untersucht werdendie embryonalen und Larvenstadien, wenn neurologische Verarbeitung fehlt oder operative auf niedrigem Niveau 12,13.
Bisher eine Vielzahl von chemischen genetischen Screens wurden durchgeführt unter Verwendung Zebrafischembryonen insbesondere als Verbindung Lieferung kann durch Eintauchen Embryonen in Medien, enthaltend das Arzneimittel von Interesse 12-15 erreicht werden. Ferner gab es zahlreiche wissenschaftliche und technologische Fortschritte chemische genetischen Screens möglich und überschaubar 16-20 zu machen. Peterson und Kollegen waren die ersten, Zebrafisch in einer chemisch-genetischen Bildschirm nutzen im Jahr 2000 und später im Jahr 2004 identifizierte eine Verbindung, die eine Aortenisthmusstenose Mutation im Zebrafisch 21,22 drückt. Chemische Bildschirme sind seit implementiert worden, um mehreren Entwicklungs Geweben (zB die Herz, Blut, Gefäße) 23-25, physiologische Funktionen (zB neurologische Grundlage für Verhalten) 26, erwachsener Regeneration 27,28 und diseas studieren e-Modellen (zB Muskeldystrophie und Krebs) 29,30. Von diesen Zebrafisch chemische Bildschirme, hat die Entdeckung, dass Prostaglandine regulieren hämatopoetischen Stammzellen zu klinischen Studien beim Menschen getroffen worden, was die Leistung, die von "Tank to bedside" bewegen 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). In jüngerer Zeit haben vielversprechender Kandidat Therapeutika für komplexe Organe wie Niere, die zelluläre Pathologie bei polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) 34 und akutem Nierenversagen 27,35 sanieren entstanden, obwohl diese noch nicht zu klinischen Studien zu bewegen. Diese chemischen genetischen Screens breit zeigen die Nützlichkeit der Prüfung kleiner Verbindungen in den Entwicklungszebrafisch und die Fähigkeit, chemische Genetik gelten für erwachsene Gewebefunktion zu verhören. Darüber hinaus gibt es eine wachsende Liste von im Handel erhältlichen Pharmakologie Sammlungen, die für ein Studium 19 zur Verfügung stehen.
ove_content "> In den letzten Jahren gab es Fortschritte in der chemischen prominente genetischen Screening-Technologie, einschließlich der Verwendung von automatisierten Systemen von Robotern für die Arzneimittelabgabe und Handhabung sowie automatische Abbildungssysteme 36-38. Derartige Systeme erlauben die Möglichkeit, Testen viele Tausende von Verbindungen sowohl HTS und HCS 36-38 zu erreichen. Leider ist die Verpflichtung von chemischen genetischen Screens mit diesen innovativen Roboter Unternehmen benötigen in der Regel erhebliche Ressourcen. Diese Arten von Ressourcen sind ein großes Hindernis für viele Unternehmen, die der Hauptstadt fehlt zum Erwerb , Betrieb und Wartung solcher Instrumente. Während die Gründung der Infrastruktur für Robot-chemischer Bibliotheken, einschließlich der Übertragung der Embryonen zu Platten angeordnet sind, bleibt unerschwinglich für viele Labors, Automated Imaging und Analyse ist in der Regel leichter zugänglich 12. Automatisierte Bild Screening ermöglicht die Quantifizierung fluoreszierender transgenen reGepäckträger und erleichtert bestimmte phänotypische Analyse 12,15.Obwohl automatische Systeme stellen nützliche technologische Fortschritte, kann viele Fragen durch gezieltere manuelle Bildschirme angesprochen werden, wie die Abfrage von mehreren tausend biologisch aktiven Verbindungen auf einem Entwicklungsprozess mit einer ganzen-mount in situ Hybridisierung (WISH) Auslese 39. Während ferner eine zunehmende Anzahl von Laboren haben Zebrafisch chemische Bildschirme aufgerufen, um eine Forschungsfrage zu untersuchen, wenige (wenn überhaupt) Bemühungen Sättigung erreicht und viele Themen sind noch nicht mit chemischen Genetik durchbrochen werden. Chemische Bildschirme können mit einem kleinen Zebrafisch Kolonie aus nur wenigen transgenen Wildtyp oder Tanks ausgeführt werden. Daher sollte diese Form der genetischen Verhör erreichbar von den meisten Zebrafisch Forschungsgruppen in den Ausbau / Diversifikation in dieser Arena. Chemischen Bibliotheken unterschiedlicher Größe können von einem kommerziellen Händler und / oder col beschafft werdenlaborators. Aus diesen Gründen kann die chemische Genetik auch in rauen Klimazonen Finanzierung wirtschaftlich machbar sein. Allerdings gibt es Hürden zu Beginn einer chemischen Genetik Bildschirm, wie, wie man logistische Aspekte der Bildschirm zu planen: zB die Zahl der Mitarbeiter für eine erfolgreiche Bildschirm benötigt, die Zuteilung von engagierten Zeit und Zusammensetzen eine physische Protokoll manuell Prozessproben diese Zahl von den hundert bis mehreren tausend. Hier haben wir ausführlich ein manuelles Hochdurchsatz-Protokoll, um chemische Genetik im Zebrafischembryo mit WISH als Auslesezuführen. Dieses Verfahren beinhaltet medikamentöse Behandlung von Zebrafischembryonen, gefolgt von Riboprobe Nachweis von mRNA-Transkripten. Mit diesem Protokoll, ein kleines Team oder sogar ein Einzelperson angemessen zu screenen und zu analysieren, ein bescheidener chemischen Bibliothek etwa 600 Verbindungen in der Spanne von 9 Wochen.
Chemische Genetik in der Zebrafisch kann einen entscheidenden Einfluss auf das Fortschreiten der Wirkstoffforschung. Dieses Protokoll bietet eine manuelle Hochdurchsatzverfahren zur chemischen Genetik in Zebrafischembryonen durchführen mit einem Wunsch Auslesen effektiv ermöglicht eine Einzelperson oder kleine Gruppe, um ein kleines Molekül Bildschirm durchzuführen. Diese minimale-Ressource Methode erweitert die Machbarkeit der chemischen Genetik, viele Forschungsgruppen. Insbesondere liefert dieser Bildschirm-Strategie eine wichtige Alternative zur Verwendung von Roboter Instrumentierung, wie solche Systeme nicht breit über Forschungsabteilungen zugänglich. Dieses Handbuch Bildschirm ermöglicht ein einzelnes Individuum auf eine 96-Well-Platte von Verbindungen mit einem Wunsch Auslesen in einem 6 Tage-Woche zu testen. Da Zebrafisch sind eierlegend, wobei die Embryonen entwickeln außerhalb des Elternteils, und die Embryonen sind groß genug, um mit dem bloßen Auge zu sehen (zwischen 1-3 mm), zugänglich für die manuelle Handhabung mit einfachen Instrumenten und der Forscher Array Proben sind sieMultiwell-Platten ohne Verwendung eines Mikroskops. Ferner, da Zebrafisch zu entwickeln rasch kleines Molekül Belichtung wirksam mit einer einzigen Behandlung einer Verbindung, anstatt wiederholten Dosen, die manuelle Weiterverarbeitung minimiert werden. Zebrafisch-Embryonen sind leicht kultiviert, weil ihre Dotter stellt eine Quelle der Ernährung bis zu 5-6 Tage nach der Befruchtung, die die Komplikation der fry Fütterung eliminiert. Zusätzlich wird die Mehrheit der Larvenorgane entwickelt und werden in dieser Zeit, die die Möglichkeit, eine breite Palette von Forschungsfragen zu studieren bietet funktional. Wobei die einfache Zugabe von kleinen Molekülen auf den Embryo Inkubationsmedium ist nicht-invasiv und ermöglicht den Forscher (s), die für Medikamentendosis auszuwählen, die Zeit der Zugabe und Dauer der Belichtung wodurch strenge Kontrolle über viele Variablen und damit für bestimmte Entwicklungsprozesse von Interesse, die abgefragt werden. Wie hier beschrieben, können erhebliche Forschungs Produktivität in kurzer timefr erreicht werdename mit diesem Handbuch Bildschirm Methodik. Nach unserer Erfahrung gibt es eine hohe Rendite auf dem investierten Aufwand, der unter Verwendung eines bekannten bioaktiven chemischen Bibliothek, ein Verfahren von Interesse, wie nephron Segmentierung bei Nierenentwicklung analysieren akzentuiert werden können (Abbildung 4; Poureetezadi und Wingert, unveröffentlicht).
Die hier beschriebene manuelle chemische Bildschirm ist außergewöhnlich vielseitig, weil es einen Test auf festZebraFisch Proben beinhaltet. Zum Beispiel kann diese Strategie überarbeitet, um mehrere Platten von Verbindungen in einer Woche zu testen und dann zu Embryonen Stand der folgenden Woche. Alternative Assays auf festZebraFisch Proben, wie Immunhistochemie oder andere Gewebefärbung Präparate, könnte auch für den Wunsch Auslesewechselt werden. Experimentelle Strategien auszuführen zellulären Assays im Zebrafisch sind anpassungsfähig aufgrund der optischen Klarheit und Transparenz der frühen Entwicklungsstadien. Ferner können die Forscher die Pigmentierung zu späteren sta hemmenges unter Verwendung von Chemikalien oder Vermeidung der Komplikation der Pigment Entwicklung insgesamt durch den Einsatz von Pigment-less genetischen Linien wie Casper oder schiere Zebrafisch 13. Es ist möglich, kleine Moleküle manuell zu verwalten, verarbeiten den Fleck (en) von Interesse und manuell Note Embryonen mit Hilfe eines Stereomikroskops einfach. Allerdings ist es wichtig zu bedenken, dass die automatisierte Bildanalyse durchgeführt werden konnte, und kann in der Tat für Hochauflösung Phänotyp-Analyse erforderlich. Zum Beispiel kann es bevorzugt, Partner ein automatisiertes Bildanalysesystem mit einem direkten Assay sein, wie etwa einer transgenen Reporter, wie dies vereinfacht die manuelle Bearbeitung von Proben quantifiziert Unterschiede nicht leicht wahrnehmbar für das bloße Auge, und eliminiert Forscher Vorspann 15. Glücklicherweise einige automatisierte Imaging-Systeme sind sowohl benutzerfreundlich und sparsam im Softwarekosten 15. Der Einsatz und die Fähigkeiten anderer automatisierter Systeme haben sich schnell entwickelt und kannsein, orientieren Organismen verwendet, verwalten medikamentöse Behandlungen und sogar Organismen 12,15 verlagern. Diese automatisierten Systeme haben ein neues technologisches Zeitalter der Forschung eingeläutet und haben innovative Lösungen bereitgestellt, um große Mengen von Testpersonen zu manipulieren und damit durchführen HTS und HCS-Ansätze in ganzen Organismen 12,15. Während solche Maschinen sind unbestreitbar nützliche Werkzeuge, sie sind auch sehr teuer und sind außerhalb der Reichweite für viele grundlegende Forschungslaboratorien. Ohne Zugang zu diesen automatisierten Funktionen kann es scheinen, dass die chemische Bildschirme sind nicht möglich. , Umreißt jedoch dieses Protokoll einen Leitfaden, wie Sie eine manuelle Bildschirm, der verwendet werden kann, um eine chemische Genetik Bildschirm auf eine praktische Weise über einen angemessenen Zeitraum abzuschließen befragen.
Nachteile für manuelle Screening und chemische Genetik im allgemeinen vorhanden ist, und sollte im Hinterkopf, wenn man eine chemische Bildschirm gehalten werden. Insbesondere das Verfahren hier gezeigt erfordert eine mäßigeder körperlichen Geschicklichkeit. Diese Sorge ist vermindert oder vollständig durch Wiederholung vermieden, wie Fingerfertigkeit mit der Praxis zu verbessern. Zusätzlich gibt es minimalen Raum für grobe Fehler, da es nur 10 Embryonen pro Vertiefung für die Analyse. Kleine Moleküle können in der Penetranz des Phänotyps, die induziert wird, variieren, so dass eine angemessene Punkteschema Verbindungen von Interesse sind einzuhalten, um zu identifizieren. Entscheidend ist, dass die Forscher nutzen dieses Protokoll auszuarbeiten geeigneter strenge Kriterien für das, was sie einen Hit zu betrachten. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Art dieser Form der Bildschirm wird wahrscheinlich einen gewissen Anteil der Fehlalarme, die durch weitere chemische Aufarbeitung abgegrenzt werden kann ergeben. Ferner ist es wichtig, Embryonen genau zu inszenieren und Kupplungen für das Screening kurz nach der Befruchtung zu sammeln, als asynchrone Entwicklung kann zu Komplikationen in der Wirkung der medikamentösen Behandlungen genau Auswertung führen. Ferner wird in Bezug auf chemische Screening als Exexperimentelle Strategie, gibt es eine Fülle von Einschränkungen. Verbindung Löslichkeit und Toxizität von Trägermolekülen (zB Dimethylsulfoxid (DMSO)) kann auch ein Problem darstellen und können unerschwinglich in Prüfung vieler Moleküle sein. Das Chorion kann auch als Hindernis für die Wirkstoffexposition zu handeln. Schließlich, obwohl Zebrafisch ein leistungsfähiges und Translationsmodell für chemische Genetik, Pflege sollte immer bei der Bestimmung, ob eine alternative chemische Bildschirm Strategie, beispielsweise unter Verwendung eines in vitro Systems, wie einer Zelllinie entnommen werden kann, kann die Verwendung von ganzen ersetzt werden Tiere. Dennoch wird die chemische Behandlung in der ganzen Zebrabärbling-System als bevorzugt angesehen, die ähnliche Ansätze in Säugetieren, da sie den Vorteil der Erfassung der systemischen Wirkungen der Verbindungen und Forschern ermöglichen, die Liste der Verbindungen, die in einem Säugetiermodell getestet werden sichten.
Bisher wurden Zebrafisch chemische Bildschirme eine leistungsstarke experimentelles Werkzeug t vorgeseheno abzugrenzen, die Mechanismen der Entwicklung und den Kandidaten pharmakologische Mittel zur Verwendung in der Medizin zu ermitteln, wie die Identifizierung von Molekülen, die Verhütung von Krankheiten Pathologien. Zum Beispiel kann eine Studie von Burns und Kollegen entwickelten eine automatisierte Mikro gut Assay für Herzfrequenz mit transgenen Zebrafischembryonen, die GFP im Myokard 42 ausgedrückt. Sie benutzten diese transgene Linie um die Herzfrequenz in der Entwicklung zu analysieren und wie es war auf medikamentöse Behandlung 42 betroffen. Eine weitere Studie, durch die Prüfung der Bevölkerungsdichte von hämatopoetischen Stammzellen im Zebrafischembryo, festgestellt, dass Prostaglandin E2 reguliert den HSC Nische 23. Diese Feststellung wurde in der Maus validiert und wurde später für die klinische Prüfung in der menschlichen Nabelschnur Transplantationen 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314) implementiert. Durch mehrere aktuelle Studien, hat chemische Genetik bewährt bei der Untersuchung einer Nierenerkrankung mit der Zebrafisch zu sein <sbis> 43. Der Zebrafisch Nieren eine ausgezeichnete Paradigma Nephrogenese oder Regenerierung des Nephrons, die Funktionseinheit, die die Niere während der Entwicklung und akutem Nierenversagen 43 umfassen studieren. Nephron Struktur ist stark zwischen dem Zebrafisch embryonalen Niere und der erwachsenen Säugetierniere 44-50 konserviert. Mehrere Studien, die Zebrafisch embryonalen Nieren verdeutlichen seine inhärente translationalen Potenzial, wenn sie mit chemischen Genetik. Eine chemische Genetik Bildschirm wurde auf zwei Zebrafisch-Mutanten, die auf die Gene PKD2 und ift172, die bekanntermaßen die Hauptakteure in der polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) 34 sein kartiert wurden durchgeführt. Der Bildschirm in Folge Identifizieren der pan-Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitor Trichostatin A (TSA) als ein kleines Molekül, das die morphologischen Defekten normalerweise in den mutierten Embryonen gesehen zunichte machen könnte. Ein anderer Ansatz von de Groh und Kollegen getroffen für Verbindungen, die Induc gescreented Ödem in Wildtyp-Zebrafischembryonen, die eine Störung der Nierenfunktion 35 anzeigen würde. Nach der Identifizierung PTBA als Treffer beobachteten sie, dass zusätzlich zu verursachen Ödeme, PTBA erhöht die Expression von pax2a, einen Marker für Nieren Vorläufern. Wichtig ist, dass eine optimierte Ableitung von PTBA dann gezeigt, um die prozentuale Fatalität erwachsenen Zebrafisch, die Gentamicin-induzierte Nierenschäden unterzogen und darüber hinaus beschleunigt die Erholung der Mäuse, die von Nierenschäden erlitten 27 verringern. Zusammengenommen sind diese Beiträge aus Zebrafisch chemische Genetik präsentieren die Arten von Entdeckungen, die mit Hilfe der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.
Während chemische Genetik Forschung trägt erhebliche Verdienst ist es nicht ohne gewisse Herausforderungen. Ausschließlich unter Verwendung eines chemischen Genetik Ansatz machen es kompliziert, um das spezifische Gen oder Gene, die von einer Verbindung betroffen sind zu bestimmen. Selbst wenn ein Target (s) gefunden wird, a significant Lücke zwischen Verbindung Identifikation und Verständnis des Mechanismus (n) der Aktion, in der das kleine Molekül verhält sich bleiben. Zum Beispiel kann es schwierig sein, den Mechanismus, bei dem ein kleines Molekül handelt, da eine einzelne Verbindung, die mit einem Bereich von unterschiedlichen Wirkungen im Organismus bestimmen. Jedoch mit dem Aufkommen neuer Technologien und chemische genetischen Screens in Zebrafisch abgeschlossen, das Problem der Bestimmung eines Mechanismus schrumpft. Ein Verfahren, um festzustellen, die molekularen Effekte der identifizierten Verbindungen ist, um eine Medikamentenbibliothek bekannter bioactives für Screening, wo Mechanismen können möglicherweise von vorher kommentierten Daten abgeleitet werden soll. Zusätzlich Chemoinformatik Algorithmen wie Discovery-Gate sind für die Verwendung, die strukturelle Ähnlichkeiten einer Verbindung mit einer Datenbank von Verbindungen zugeschrieben Mechanismen 14 vergleichen erhältlich. Noch ein anderer Weg, um den Mechanismus der Verbindung zu erhellen wäre, einen MICR erzeugenoarray nach Behandlungsprofil und dann abfragen dieses Profil in einer Zusammenstellung von Mikroarray-Drogenprofile wie Connectivity Map, auf der Suche nach mechanistisch definierte Verbindungen, die eine ähnliche Wirkung 14 zu entlocken. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um genetische Mutanten, die eine ähnliche Wirkung wie die Verbindung von Interesse zu identifizieren sein. Suche nach einer Verbindung zwischen einer Verbindung und einer Mutante könnte darauf hindeuten, dass die Verbindung funktioniert molekular stromaufwärts oder stromabwärts des zugehörigen Gens, das durch Behandlung der Mutanten mit der Verbindung und Morpholino abgegrenzt werden könnten. Eine andere Möglichkeit wäre die Massenspektrometrie, die weiterhin mehr Optimiert für Zebrafisch geworden ist sein. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um spezifische Protein-Änderungen oder post-translationale Modifikationen nach der Arzneimittelbehandlung abzugrenzen. Schließlich kleine Moleküle oder sogar ganze Bibliotheken sind manchmal in der Lage ist für Pull-Down der Bindungspartner markiert. Es ist auch erwähnenswert, dass, während der Mechanismus, wie ein kleines Molekül Funktionen is bedeutender Import, gibt es von der FDA zugelassene Medikamente, für die die Mechanismen unbekannt bleiben.
Obwohl Zebrafisch weisen viele Ähnlichkeiten mit Säugetieren genetisch und physiologisch, gibt es immer noch ein Problem der Arzneimittelweiche 14. Eine Studie untersuchte die Crossover-Fähigkeit der Treffer von einem Bildschirm zum Zellzyklus-Inhibitoren in Zebrafischembryonen 50. Der Bildschirm führte zur Identifizierung von 14 Treffern, die vorher unbekannt Zellzyklusaktivität besitzen waren. Von diesen 14 Verbindungen, 6 wurde festgestellt, Zellzyklusaktivität in Mensch und Zebrafisch Zellkulturassays haben, wurden 3 gezeigt, dass Serum inaktiviert in Zellkulturassays, 1 war nur in Zebrafisch-Zellen aktiv ist, und 4 hatte keine Aktivität in entweder Zebrafisch oder menschliche Zellkulturassays, sondern nur in dem Zebrafisch gesamten Organismus. Bemerkenswert ist, die 4 Verbindungen, die nur in der Zebrafisch hatte Aktivität zeigen, dass es Unterschiede zwischen Zebrafisch und Säugetieren, die prohi kannbiss die Translations Potenzial bestimmter Verbindungen. Dies ist eine wichtige Überlegung bewusst zu sein, aber es gibt Beispiele für kleine Moleküle, wie PGE 2, die die Fähigkeit von HSZ in menschlichen Empfängern und PTBA-Derivate, die die Geschwindigkeit der Wiederherstellung der Nieren in Säugern zu verbessern engraft verstärkt, wodurch der Beweis der Grundsatz, dass die Frequenzweiche ist möglich 23,31-33.
Unabhängig von diesen Fallstricke, chemische Genetik und dieser minimal-Ressource-Ansatz hat viel zu der Forschungsgemeinschaft anbieten. Chemische Genetik ist besonders nützlich in der Zebrafisch und wird auch weiterhin eine entscheidende Rolle bei molekularen Signalweg Verhör und Medikamentenentwicklung zu spielen. Chemische Bildschirmen basierend auf diskreten molekularen Ziele dieser Art unterliegen einer hohen Ausfallrate aufgrund von, was als die Konstellation der Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und toxikologischen (ADMET) Eigenschaften 51 bekannt. Chemische Bildschirmen Verwendung Zebrafisch zukonzentrieren sich auf einen Prozess, anstatt eine diskrete Ziel können mehrere ADMET Probleme zu umgehen und zu identifizieren Verbindungen, die wirksam in dem Kontext des gesamten Organismus. Mit der zunehmenden Ressourcenpool für Zebrafischforschung, einschließlich der aktuellen Mutantenstämme und die Fähigkeit, Genom Bearbeiten verwenden, um gezielte genetische Mutanten und transgenen erstellen verfügbar, gibt es praktisch eine unbegrenzte Anzahl von möglichen chemischen genetischen Screens mit Zebrafisch. Viele chemische Bibliotheken wurden kuratiert, und Spanne Kollektionen mit bekannten bioactives, neue Verbindungen, strukturell vielfältigen und strukturell ähnlich. Diese Reagenzien liefern eine Fülle von spannenden Möglichkeiten für Bildschirm-Kombinationen, die derzeit verfügbar sind und werden wahrscheinlich in den kommenden Jahren weiter wachsen. Mit diesen Möglichkeiten in der Hand, bietet dieses Handbuch und Hochdurchsatz-Protokoll eine praktische und benutzerfreundliche Weise, um die Fähigkeit von Forschungsgruppen, um chemische genetischen Screens verpflichten mit Zebrafisch zu erhöhen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung zum Wingert Forschungslabor aus der folgenden unterstützt: National Institutes of Health gewährt K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Bezuschussungs # 5-FY12-75; Startkapital von der University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; und ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame von Elisabeth und Michael Gallagher im Namen der Gallagher Familie zu fördern Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken Paul T. Kröger, Jr. für die Bereitstellung von kritischen Rückmeldungen zum Manuskript. Wir danken den Mitarbeitern der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Zebrafisch Forschung an der Notre Dame für ihre herausragenden Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer research Labor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit.
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |