zebrafish हड्डीवाला विकासात्मक प्रक्रियाओं और मॉडल मानव रोग का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रायोगिक जीव है. यहाँ, हम एक साथ zebrafish भ्रूण में एक पुस्तिका उच्च throughput रासायनिक स्क्रीन प्रदर्शन के लिए पर एक प्रोटोकॉल का वर्णन पढ़ने के लिए बाहर सीटू संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट.
Zebrafish कारण मनुष्यों के साथ आनुवंशिक संरक्षण की उनकी काफी हद तक एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीव विकासात्मक जीव विज्ञान आबाद तंत्र है कि जांच करने के लिए और मानव रोग विकृति का अध्ययन करने के लिए बन गए हैं. रासायनिक आनुवंशिकी एक जैविक प्रक्रिया पर छोटे अणुओं है कि प्रभाव का परीक्षण जरूरत पर जोर देता है और चिकित्सीय यौगिकों की पहचान करने के लिए एक लोकप्रिय शोधों तरीका बनता जा रहा है. Zebrafish विशेष रूप से, क्योंकि बाहर से निषेचित कर रहे हैं जो पारदर्शी भ्रूण की बड़ी चंगुल उत्पादन करने की क्षमता के रासायनिक आनुवंशिकी के लिए उपयोग करने के लिए अपील कर रहे हैं. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण आसानी से भ्रूण मीडिया के लिए एक यौगिक के सरल अलावा द्वारा इलाज दवा हो सकता है. का प्रयोग सीटू संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट, mRNA अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से zebrafish भ्रूण के भीतर देखे जा सकते हैं. साथ में, रासायनिक आनुवंशिकी और इच्छा का उपयोग, zebrafish सेलुलर और शारीरिक निर्धारित करने के लिए जो में एक शक्तिशाली पूरे जीव संदर्भ बन जाता हैछोटे अणुओं के प्रभाव. अभिनव अग्रिम हालांकि इस तरह के विकल्प उपलब्ध नहीं हैं या लागत निषेधात्मक रहना कई प्रयोगशालाओं के लिए, मशीन-आधारित स्क्रीनिंग प्रक्रिया का उपयोग प्रौद्योगिकियों कि में बनाया गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बुनियादी संसाधनों की आवश्यकता है और समय की एक कुशल अवधि में एक भी व्यक्ति या छोटे दल द्वारा पूरा किया जा सकता है कि एक पुस्तिका उच्च throughput रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन पर अमल करने के लिए कैसे करें. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल विकासात्मक प्रक्रियाओं, रोग तंत्र में मौलिक अंतर्दृष्टि पाने के लिए उपयोगी हो सकता है, और चिकित्सकीय प्रासंगिक आवेदन किया है कि उपन्यास यौगिकों और संकेत दे रास्ते की पहचान करने के लिए जो zebrafish में रासायनिक आनुवंशिकी प्रदर्शन करने के लिए अनुसंधान समूहों द्वारा लागू किया जा सकता है कि एक व्यावहारिक रणनीति, प्रदान करता है .
मानव बीमारी के इलाज के लिए प्रभावी उपचारात्मक दवाओं की पहचान के कई जैव चिकित्सा शोधकर्ताओं के लिए एंडगेम है. नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए संभावित औषधीय एजेंटों की पहचान और लक्षण वर्णन स्वास्थ्य के लिए स्पष्ट मूल्य है, इसलिए यह एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. अंत में, कई चिकित्सीय यौगिकों के विकास के विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को विकसित करने या समारोह या तो कैसे के ज्ञान से आता है. zebrafish, Danio rerio, विकासात्मक जीव विज्ञान 1 में एक मुख्यधारा मॉडल जीव बन गया है कि Cyprinidae परिवार का एक मीठे पानी teleost है. Zebrafish आनुवंशिक रूप से वैज्ञानिक अध्ययन 2,3 के लिए बनाए रखने और हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं कि विनयशील रीढ़ हैं. zebrafish भ्रूण बाहर से निषेचित, पारदर्शी है, और केवल एक सप्ताह 2,3 में एक भी वयस्क संभोग जोड़ी से सैकड़ों द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. इसके अलावा, zebrafish शेयर प्रमुख अंग प्रणालियों और एक बड़ी घ अधिकारीमनुष्य 4 सहित स्तनधारियों, साथ आनुवंशिक समानता के egree. Strikingly, मानव जीन के 70% एक zebrafish orthologue 4 है. इस वजह से यह समानता के लिए, zebrafish हड्डीवाला विकास और शरीर विज्ञान के तंत्र के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक प्रायोगिक प्रणाली किया गया है, और मानव रोगों 5-7 की एक भीड़ पुनरावृत्ति करने के लिए नियोजित किया गया है. इन कारणों से, दूसरों के बीच में, आनुवंशिक पूछताछ जारी रखने के लिए zebrafish एक आदर्श उम्मीदवार बना दिया है और जैव चिकित्सा अनुसंधान 6,7 में zebrafish के उपयोगिता के लिए एक तेजी से बढ़ सराहना हुई है.
पिछले कुछ दशकों में, आनुवंशिक उपकरणों की एक बहुतायत zebrafish में विकसित किया गया है. zebrafish जीनोम उत्परिवर्तजनन और transgenesis 3 करने के लिए उत्तरदायी है. तिथि करने के लिए, एक आगे की अधिकता और आनुवंशिक अध्ययनों रिवर्स 9,000 म्यूटेंट 3 की पीढ़ी के लिए अग्रणी प्रदर्शन किया गया है. इसके अलावा, कई ट्रांसजेनिक लाइनों होना हैएन विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं 3 की लेबलिंग और अलगाव के लिए सक्षम है, जो बनाया. Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र (ZIRC) 8 के माध्यम से नहीं बल्कि एक कम कीमत पर प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच रहे हैं, जो अनुसंधान समुदाय के लिए इन संसाधनों को केंद्रीकृत और वितरित करने के लिए महत्वपूर्ण चल रहे प्रयासों की गई है. इसके अलावा, जैविक जानकारी और दृश्यों और प्रोटोकॉल morpholino के लिए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न से लेकर आणविक उपकरण, की एक व्यापक भंडार, उत्तरोत्तर Zebrafish सूचना नेटवर्क (ZFIN) 9-11 पर एनोटेट किया गया है. ये zebrafish अनुसंधान infrastructures महत्वपूर्ण एनआईएच समर्थन और इस पशु मॉडल 8 की वकालत के माध्यम से संभव बनाया गया है. Zebrafish म्यूटेंट, ट्रांसजेनिक लाइनों, और उचित जानकारी के इस कैश को बड़े पैमाने पर जैविक अनुसंधान समुदाय को असाधारण मूल्य का होना जारी है. Zebrafish अब एक अच्छी तरह से स्थापित और पूर्व प्रख्यात मॉडल जीव हैं हालांकि, जबकि, वे एक ला प्रतिनिधित्वrgely अप्रयुक्त जलाशय रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के उपयोग के माध्यम से विकासात्मक जीव विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए.
रासायनिक आनुवंशिकी रहने वाले एक प्रणाली 12 के भीतर एक जैविक प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए ऐसी दवाओं या अन्य यौगिकों के रूप में छोटे अणुओं, का उपयोग है. रासायनिक आनुवंशिकी एजेंटों कि बचाव की पहचान या एक विशिष्ट आनुवंशिक दोष 12 ख़राब करने के लिए इस तरह के रूप में, जीन समारोह की आणविक तंत्र को समझने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, रासायनिक आनुवंशिकी शोधों 12 का संचालन करने के लिए एक प्रमुख एवेन्यू का प्रतिनिधित्व करता है. पशु मॉडल में परंपरागत आगे आनुवंशिक स्क्रीन रोगों के लिए विशिष्ट जीन को जोड़ने में काफी शक्तिशाली किया गया है, वे यह मुश्किल या कभी कभी असंभव जल्दी embryogenesis के बाद पैदा होता है कि phenotypes के निरीक्षण करने के लिए कर रही है, एक अस्थायी आयाम की कमी है. साथ ही, जीन अतिरेक व्याख्या करने के लिए आगे आनुवंशिकी से मनाया परिणाम कठिन बना सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीनठीक अस्थायी नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं और एक साथ दवाओं की खोज 12,13 के लिए एक मूल्यवान प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं.
रासायनिक आनुवंशिकी इस तरह के एक पूरे जीव के रूप में (उदाहरण के लिए, सेल लाइनों, प्रोटीन) इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग कर या एक में विवो प्रणाली, का उपयोग किया जा सकता है. रासायनिक आनुवंशिकी के लिए इन विट्रो प्रणाली का उपयोग करते हुए यह कम महंगा एक बड़े पैमाने पर साथ काम करना आसान है, एक पूरे जीव प्रणाली की तुलना में आसान है क्योंकि फायदेमंद हो सकते हैं, और कम समय लेने वाला. नतीजतन, इन विट्रो सिस्टम उच्च throughput स्क्रीनिंग (एचटीएस) और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) दोनों के लिए अनुमति देते हैं. यह भी एक रासायनिक आनुवंशिकी आ जब विचार किया जाना चाहिए कि इन विट्रो प्रणाली का उपयोग करने के लिए फायदे की संख्या, लेकिन महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. एक सेल लाइन का उपयोग करने के लिए एक प्रमुख सीमा छोटे अणुओं एक विशेष सेल लाइन में प्रभावोत्पादक और गैर-विषाक्त हो सकता है, अभी तक एक पूरे जीव में पेश किया जब विषाक्त हो सकता है. इस प्रकार, जड़मुद्दे की इन विट्रो में सिस्टम एक जीव के व्यापक संदर्भ कब्जा नहीं है और इसलिए हमेशा सही रूप में एक पूरे जीव में क्या होता है नकल करने में सक्षम नहीं हैं कि है. पूरे जीवों में यौगिक परीक्षण के इन मुद्दों को दरकिनार कर सकते हैं, स्तनधारी पूरे जीव मॉडल का उपयोग भौतिक और नैतिक सीमाओं के एक नंबर बना हुआ है. उदाहरण के लिए, माउस में दवा स्क्रीनिंग logistically एक पर्याप्त नमूना आकार परीक्षण करने के लिए आवश्यक स्थान और व्यय से रुकावट है. इसके अलावा, विकासात्मक सवालों कारण स्तनधारियों utero में विकसित तथ्य यह है कि, अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है. जैव चिकित्सा अनुसंधान का संचालन विशाल सामाजिक मूल्य है, जबकि अंत में, फिर भी गहन अध्ययन के सीमित और दर्द को समाप्त करने और अनुसंधान के लिए इस्तेमाल जानवरों के पीड़ित द्वारा पशु कल्याण की रक्षा करने के लिए पर्याप्त जरूरत है. Zebrafish स्तनधारियों की तरह उच्च रीढ़ के साथ काम करने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करते हैं, और इसके अलावा, कई विषयों पर रासायनिक आनुवंशिकी का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता हैभ्रूण और लार्वा चरणों न्यूरोलॉजिकल प्रसंस्करण एक कम स्तर 12,13 में अनुपस्थित या ऑपरेटिव है जब.
यौगिक वितरण ब्याज 12-15 की दवा युक्त मीडिया में भ्रूण डुबो कर पूरा किया जा सकता है के रूप में तारीख करने के लिए, रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के असंख्य, विशेष रूप से zebrafish भ्रूण का उपयोग किया गया है. इसके अलावा, रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन संभव है और 16-20 प्रबंधनीय बनाने के लिए कई वैज्ञानिक और तकनीकी विकास किया गया है. पीटरसन और उनके सहयोगियों ने 2000 में एक रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन में zebrafish उपयोग करने के लिए पहले थे, और बाद में 2004 में zebrafish 21,22 में एक महाधमनी निसंकुचन उत्परिवर्तन दबा दिया कि एक परिसर की पहचान की. रासायनिक स्क्रीन के बाद से कई विकासशील ऊतकों (जैसे, दिल, रक्त वाहिकाओं) 23-25, शारीरिक कार्यों (जैसे, व्यवहार के लिए मस्तिष्क संबंधी आधार) 26, वयस्क उत्थान 27,28, और diseas अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है ई मॉडल (जैसे, पेशी dystrophy और कैंसर) 29,30. इन zebrafish रासायनिक स्क्रीन के बीच में से, प्रास्टाग्लैंडिनों hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को विनियमित खोज की है कि "बिस्तर के लिए टैंक" से स्थानांतरित करने के लिए शक्ति प्रदर्शन, मानव में चिकित्सीय परीक्षण के लिए लिया गया है 23,31-33 (एनआईएच, क्लीनिकल Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). इन क्लिनिकल परीक्षण के लिए ले जाने के लिए अभी तक है, हालांकि हाल ही में, होनहार उम्मीदवार चिकित्सा विज्ञान, पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (PKD) 34 और तीव्र गुर्दे की चोट 27,35 में सेलुलर पैथोलॉजी remediate जो गुर्दे की तरह जटिल अंगों, के लिए उभरा है. ये रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन मोटे तौर पर विकासशील zebrafish और वयस्क ऊतक समारोह पूछताछ के लिए रासायनिक आनुवंशिकी लागू करने की क्षमता में छोटे यौगिकों के परीक्षण की उपयोगिता प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, अकादमिक अध्ययन 19 के लिए उपलब्ध हैं कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध औषध संग्रह की बढ़ती सूची है.
पिछले कई वर्षों में ove_content ">, स्वचालित इमेजिंग सिस्टम 36-38 के साथ साथ, दवा वितरण और हैंडलिंग के लिए रोबोट की स्वचालित प्रणाली के उपयोग सहित रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रमुख अग्रिमों, वहाँ किया गया है. इस तरह की प्रणाली की संभावना के लिए अनुमति यौगिकों के कई हजारों का परीक्षण दोनों एचटीएस और HCS के 36-38 प्राप्त करने के लिए. दुर्भाग्य से, इन नए रोबोट उद्यमों के साथ रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के उपक्रम आम तौर पर काफी संसाधन की आवश्यकता होती है. संसाधनों के इन प्रकार के अधिग्रहण के लिए पूंजी की कमी है कि कई संस्थानों के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा हैं प्लेटों arrayed को भ्रूण के हस्तांतरण सहित रासायनिक पुस्तकालयों के रोबोट से निपटने के लिए बुनियादी सुविधाओं की स्थापना करते हैं, काम करते हैं, और इस तरह के उपकरण बनाए रखें., कई प्रयोगशालाओं, स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण के लिए अत्यधिक लागत आम तौर पर और अधिक सुलभ है रहता है 12. स्वचालित छवि स्क्रीनिंग मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक फिर सेकुलियों और विशिष्ट प्ररूपी विश्लेषण 12,15 सुविधा.स्वचालित प्रणाली उपयोगी तकनीकी विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं, कई सवाल ऐसे सीटू संकरण (इच्छा) readout के 39 में एक साबुत माउंट के साथ एक विकासात्मक प्रक्रिया पर कई हजार biologically सक्रिय यौगिकों के प्रश्न के रूप में, और अधिक ध्यान केंद्रित पुस्तिका स्क्रीन से संबोधित किया जा सकता है. प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ने के एक अनुसंधान प्रश्न की जांच करने के लिए zebrafish रासायनिक स्क्रीन लागू किया है, जबकि इसके अलावा, कुछ प्रयासों पर पहुँच गए हैं (अगर कोई है) संतृप्ति और कई विषयों रासायनिक आनुवंशिकी का उपयोग कर उल्लंघन किया जाना अभी बाकी है. रासायनिक स्क्रीन केवल कुछ जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक टैंक से मिलकर एक छोटे zebrafish कॉलोनी का उपयोग कर मार डाला जा सकता है. इसलिए, आनुवंशिक पूछताछ के लिए इस प्रपत्र / विस्तार इस क्षेत्र में विविधता लाने में दिलचस्पी सबसे zebrafish अनुसंधान समूहों द्वारा प्राप्य होना चाहिए. अलग-अलग आकार के रासायनिक पुस्तकालयों एक वाणिज्यिक वितरक और / या कर्नल से प्राप्त किया जा सकता हैlaborators. इन कारणों के लिए, रासायनिक आनुवंशिकी भी कठोर वित्त पोषण के मौसम में आर्थिक रूप से व्यवहार्य हो सकता है. उदाहरण के लिए, एक सफल स्क्रीन के लिए आवश्यक कर्मियों की संख्या, एक साथ समर्पित समय और piecing का आवंटन एक शारीरिक प्रोटोकॉल के लिए मैन्युअल प्रक्रिया नमूने: हालांकि, इस तरह के स्क्रीन के सैन्य पहलुओं योजना कैसे के रूप में एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन शुरू करने के लिए बाधाओं, कर रहे हैं कई हजार तक सैकड़ों से उस नंबर. यहाँ, हम विस्तार से एक पुस्तिका उच्च throughput प्रोटोकॉल एक पढ़ा-बाहर के रूप में इच्छा के साथ zebrafish भ्रूण में रासायनिक आनुवंशिकी प्रदर्शन करने के लिए. इस विधि mRNA टेप की riboprobe का पता लगाने के द्वारा पीछा zebrafish भ्रूण की दवा उपचार, शामिल है. यथोचित स्क्रीन कर सकते हैं इस प्रोटोकॉल, एक छोटी सी टीम या एक भी व्यक्ति का उपयोग करना और 9 सप्ताह की अवधि में एक मामूली रासायनिक पुस्तकालय लगभग 600 यौगिकों का विश्लेषण.
Zebrafish में रासायनिक आनुवंशिकी दवाओं की खोज की प्रगति पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव बना सकते हैं. इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से एक छोटा सा अणु स्क्रीन का संचालन करने के लिए एक व्यक्ति या छोटे दल को सक्षम करने, एक इच्छा पढ़ने के लिए बाहर के साथ zebrafish भ्रूण में रासायनिक आनुवंशिकी प्रदर्शन करने के लिए एक पुस्तिका उच्च throughput तरीका प्रदान करता है. यह कम से कम-संसाधन विधि कई अनुसंधान समूहों के लिए रासायनिक आनुवंशिकी की व्यवहार्यता फैली हुई है. ऐसी व्यवस्था मोटे तौर पर अनुसंधान विभागों में सुलभ नहीं हैं विशेष रूप से, इस स्क्रीन रणनीति, रोबोट उपकरण का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण विकल्प प्रदान करता है. इस पुस्तिका स्क्रीन एक ही व्यक्ति एक 6 दिन काम सप्ताह में एक इच्छा readout के साथ यौगिकों में से एक 96 अच्छी तरह से थाली परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है. Zebrafish चूंकि भ्रूण माता पिता बाहर के विकास के साथ, डिंबप्रसू हैं, और भ्रूण, वे पुस्तिका साधारण उपकरणों से निपटने और शोधकर्ता कर सकते सरणी नमूनों में के लिए उत्तरदायी हैं (मिमी 1-3 के बीच) नग्न आंखों से देखने के लिए काफी बड़े हैंएक माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल के बिना बहु अच्छी तरह प्लेटें. Zebrafish तेजी से विकसित के बाद से इसके अलावा, छोटे अणु लोगों तक पहुंचाने के लिए आगे का मार्गदर्शन प्रसंस्करण जो कम से कम एक एक यौगिक का ही इलाज के बजाय दोहराया खुराक के साथ प्रभावी हो सकता है. उनके जर्दी खिला भून की जटिलता को समाप्त जो 5-6 दिनों के बाद निषेचन, के लिए पोषण का एक स्रोत प्रदान करता है क्योंकि zebrafish भ्रूण आसानी से संवर्धित कर रहे हैं. साथ ही, लार्वा अंगों के बहुमत विकसित और अनुसंधान सवालों की एक विस्तृत सरणी के अध्ययन का अवसर प्रदान करता है जो इस अवधि के दौरान कार्यात्मक हो गए हैं. भ्रूण ऊष्मायन मीडिया के लिए छोटे अणुओं के सरल इसके अलावा गैर इनवेसिव है और शोधकर्ता (ओं) दवा खुराक के लिए चयन करने के लिए, इसके अलावा के समय, और की अवधि की अनुमति देता है जोखिम-इस प्रकार कई चर पर कड़ा नियंत्रण प्रदान करने और विशिष्ट विकासात्मक प्रक्रियाओं के लिए अनुमति ब्याज के पूछे होंगे. यहाँ वर्णित है, महत्वपूर्ण अनुसंधान उत्पादकता एक छोटी timefr में प्राप्त किया जा सकता हैइस पुस्तिका स्क्रीन पद्धति का उपयोग ame. (;, अप्रकाशित Poureetezadi और Wingert चित्रा 4) हमारे अनुभव में, इस तरह के गुर्दे विकास के दौरान नेफ्रॉन विभाजन के रूप में ब्याज की एक प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए एक ज्ञात bioactive रासायनिक पुस्तकालय का उपयोग करके बल जा सकता है जो निवेश के प्रयास पर एक उच्च वापसी, वहाँ है.
यह तय zebrafish नमूनों पर एक परख शामिल है क्योंकि यहाँ वर्णित पुस्तिका रासायनिक स्क्रीन असाधारण बहुमुखी है. उदाहरण के लिए, इस रणनीति से एक सप्ताह में यौगिकों के कई प्लेटें परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और फिर अगले हफ्ते भ्रूण स्कोर करने के लिए. ऐसे immunohistochemistry या अन्य ऊतक धुंधला तैयारी के रूप में तय zebrafish नमूने पर वैकल्पिक assays, भी इच्छा पढ़ने के लिए बाहर के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है. प्रायोगिक रणनीतियों zebrafish में सेलुलर assays के कारण जल्दी विकास के चरणों के ऑप्टिकल स्पष्टता और पारदर्शिता को निभा रहे हैं करने के लिए. इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने बाद में स्टेशन पर रंजकता को बाधित कर सकते हैंGES रसायनों का उपयोग कर या पूरी तरह कैस्पर या सरासर zebrafish 13 जैसे वर्णक-कम आनुवंशिक लाइनों के उपयोग के माध्यम वर्णक विकास की जटिलता से बचने. यह मैन्युअल छोटे अणुओं प्रशासन के लिए संभव है ब्याज के दाग (एस) की प्रक्रिया, और करने के लिए मैन्युअल रूप से एक सरल stereomicroscope का उपयोग भ्रूण स्कोर. हालांकि, यह स्वचालित छवि विश्लेषण किया जा सकता है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और वास्तव में उच्च संकल्प phenotype के विश्लेषण के लिए आवश्यक हो सकता है. इस नमूने की पुस्तिका प्रसंस्करण streamlines नग्न आंखों को आसानी से साफ़ नहीं मतभेद quantifies, और शोधकर्ता पूर्वाग्रह 15 समाप्त के रूप में उदाहरण के लिए, यह इस तरह के एक ट्रांसजेनिक पत्रकार के रूप में साथी एक प्रत्यक्ष परख के साथ एक स्वचालित छवि विश्लेषण प्रणाली के लिए बेहतर हो सकता है. सौभाग्य से, कुछ स्वचालित इमेजिंग सिस्टम उपयोगकर्ता के अनुकूल दोनों सॉफ्टवेयर लागत 15 के संदर्भ में और किफायती हैं. उपयोग और अन्य स्वचालित प्रणाली की क्षमताओं को तेजी से विकसित किया है और कर सकते हैंजीवों 12,15 स्थानांतरित करने के लिए भी दवा उपचार प्रशासन, और, ओरिएंट जीवों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. ये स्वचालित प्रणाली अनुसंधान की एक नई तकनीकी युग की शुरुआत हुई है और परीक्षण विषयों की एक बड़ी मात्रा में हेरफेर और इस प्रकार एचटीएस प्रदर्शन करने के लिए अभिनव समाधान प्रदान की है और HCS के पूरे जीवों 12,15 में दृष्टिकोण. ऐसी मशीनों इसमें शक नहीं उपयोगी उपकरण हैं, वे भी बहुत महंगी हैं और कई बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर हैं. इन स्वचालित क्षमताओं के उपयोग के बिना यह रासायनिक स्क्रीन संभव नहीं हैं कि लग सकता है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के समय का एक उचित अवधि में एक व्यावहारिक रास्ता में एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक पुस्तिका स्क्रीन का संचालन करने के लिए एक गाइड की रूपरेखा.
सामान्य में दोनों मैनुअल स्क्रीनिंग और रासायनिक आनुवंशिकी के लिए कमियां मौजूद हैं, और एक रासायनिक स्क्रीन पर जब ध्यान में रखा जाना चाहिए. विशेष रूप से, यहां का प्रदर्शन विधि एक उदारवादी डिग्री जरूरीशारीरिक दक्षता की. कौशल अभ्यास के साथ सुधार होगा के रूप में यह चिंता का विषय है, कम या पूरी तरह पुनरावृत्ति के माध्यम से नहीं रही है. विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से प्रति केवल 10 भ्रूण के रूप में वहाँ ही, सकल त्रुटि के लिए कम से कम कमरा है. एक उचित स्कोरिंग आहार का पालन किया जाना चाहिए हित के यौगिकों की पहचान करने के लिए बहुत छोटे अणुओं, प्रेरित है कि phenotype के अंतर्वेधन में भिन्न हो सकते हैं. यह इस प्रोटोकॉल का उपयोग शोधकर्ताओं वे एक हिट पर विचार करेगी कि क्या के लिए उपयुक्त कठोर मानदंड चिंतन करना है कि महत्वपूर्ण है. यह स्क्रीन के इस रूप की प्रकृति सबसे अधिक संभावना आगे रासायनिक कार्य-अप के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है जो झूठी सकारात्मक, का एक निश्चित भाग निकलेगा कि मन में रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, यह ठीक भ्रूण मंच और अतुल्यकालिक विकास सही ढंग से दवा उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने में जटिलताएं पैदा कर सकते हैं, जैसा कि कुछ ही देर में निषेचन के बाद जांच के लिए चंगुल इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, एक पूर्व के रूप में रासायनिक स्क्रीनिंग करने के संबंध मेंperimental रणनीति, सीमाओं की मेजबानी कर रहे हैं. यौगिक घुलनशीलता और वाहक अणुओं की विषाक्तता (जैसे, डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO)) भी एक मुद्दा पेश कर सकते हैं और कई अणुओं के परीक्षण में निषिद्ध किया जा सकता है. जरायु भी दवा लोगों तक पहुंचाने के लिए बाधा के रूप में कार्य कर सकते हैं. अंत में, zebrafish रासायनिक आनुवंशिकी के लिए एक शक्तिशाली और translational मॉडल हैं, भले ही ख्याल हमेशा इस तरह के एक सेल लाइन के रूप में इन विट्रो प्रणाली का उपयोग, उदाहरण के लिए, एक वैकल्पिक रासायनिक स्क्रीन रणनीति निर्धारण में लिया जाना चाहिए, पूरे के उपयोग के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है जानवरों. यह यौगिकों के प्रणालीगत प्रभाव जुटाने का लाभ प्रदान करता है और एक स्तनधारी मॉडल में परीक्षण किया जाना यौगिकों की सूची ट्राइएज करने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं कर सकते हैं फिर भी, पूरे zebrafish प्रणाली में रासायनिक उपचार, स्तनधारियों में समान दृष्टिकोण का आयोजन करने के लिए बेहतर माना जाता है.
तिथि करने के लिए, zebrafish रासायनिक स्क्रीन एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण टी प्रदान की हैओ विकास के तंत्र को चित्रित और इस तरह के रोग विकृतियों को रोकने में सक्षम अणुओं की पहचान के रूप में, चिकित्सा में उपयोग के लिए उम्मीदवार औषधीय एजेंटों का पता लगाने के लिए. उदाहरण के लिए, बर्न्स और उनके सहयोगियों द्वारा एक अध्ययन मायोकार्डियम 42 में GFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण का उपयोग दिल की दर के लिए एक स्वचालित सूक्ष्म अच्छी तरह से परख विकसित की है. वे विकास में दिल की दर का विश्लेषण करने के लिए इस ट्रांसजेनिक लाइन का इस्तेमाल किया और यह दवा इलाज 42 पर कैसे प्रभावित किया गया था. एक अन्य अध्ययन में, zebrafish भ्रूण में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की जनसंख्या घनत्व परीक्षण द्वारा, प्रोस्टाग्लैंडीन E2 एचएससी आला 23 को नियंत्रित करता है कि पहचान की. यह निष्कर्ष माउस में मान्य किया गया था, और बाद में मानव गर्भनाल प्रत्यारोपण 23,31-33 (एनआईएच, क्लीनिकल Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314) में नैदानिक परीक्षण के लिए लागू किया गया था. कई हाल ही के अध्ययन के माध्यम से, रासायनिक आनुवंशिकी zebrafish का उपयोग गुर्दे की बीमारी का अध्ययन करने में उपयोगी साबित हो गया है <s> 43 अप. zebrafish गुर्दे nephrogenesis या नेफ्रॉन के उत्थान, विकास और तीव्र गुर्दे की चोट 43 के दौरान गुर्दे शामिल है कि कार्यात्मक इकाई का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रतिमान प्रदान करता है. नेफ्रॉन संरचना अत्यधिक zebrafish भ्रूण गुर्दे और वयस्क स्तनधारी गुर्दा 44-50 के बीच संरक्षित है. रासायनिक आनुवंशिकी के साथ मिलकर जब zebrafish भ्रूण गुर्दे की जांच कई अध्ययनों से स्पष्ट रूप से अपने निहित translational संभावित उदाहरण देकर स्पष्ट करना. एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (PKD) 34 में प्रमुख खिलाड़ियों माने जाते हैं जो जीन pkd2 और ift172, के लिए मैप किया गया है कि दो zebrafish म्यूटेंट पर प्रदर्शन किया गया था. स्क्रीन अखिल हिस्टोन deacetylase (HDAC) की पहचान अवरोध सामान्य रूप से उत्परिवर्ती भ्रूण में देखा रूपात्मक दोष उठा देना सकता है कि एक छोटे अणु के रूप में एक (टीएसए) trichostatin में हुई. डे Groh और उनके सहयोगियों द्वारा की गई एक अलग दृष्टिकोण induc कि यौगिकों के लिए जांचगुर्दे समारोह 35 में व्यवधान का संकेत होगा जो जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण में एड शोफ. एक हिट के रूप में PTBA पहचान करने के बाद, वे शोफ पैदा करने के अलावा, PTBA भी, गुर्दे progenitors के लिए एक मार्कर pax2a की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है कि मनाया. महत्वपूर्ण बात है, PTBA के एक अनुकूलित व्युत्पन्न तो जेंटामाइसिन प्रेरित गुर्दे की क्षति लिया और इसके अलावा, गुर्दे की क्षति 27 से सामना करना पड़ा है कि चूहों की वसूली त्वरित कि वयस्क zebrafish का प्रतिशत विपत्ति में कमी दर्ज की गई थी. साथ में ले ली, zebrafish रासायनिक आनुवंशिकी से इन योगदान इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग किया जा सकता है कि खोजों के प्रकार का प्रदर्शन.
रासायनिक आनुवंशिकी अनुसंधान पर्याप्त योग्यता भालू, यह कुछ चुनौतियों के बिना नहीं है. केवल यह एक यौगिक से प्रभावित किया जा रहा है कि विशिष्ट जीन या जीन निर्धारित करने के लिए जटिल बना सकता है एक रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण का उपयोग कर. एक लक्ष्य (ओं) पाया जाता है, भले ही एक एसआईgnificant खाई यौगिक पहचान और छोटे अणु बर्ताव करती है, जिसमें कार्रवाई के तंत्र (ओं) को समझने के बीच रह सकता है. उदाहरण के लिए, यह एक यौगिक एक जीव के भीतर अलग अलग प्रभाव की एक श्रृंखला होने में सक्षम है क्योंकि एक छोटे अणु काम कर रहा है, जिसमें तंत्र निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है. नई तकनीक और अधिक रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के आगमन zebrafish में पूरा किया जा रहा है, फिर भी, एक तंत्र का निर्धारण करने की समस्या कम होती है. पहचान यौगिकों के आणविक प्रभाव निर्धारित करने में मदद करने के लिए एक विधि तंत्र संभवतः पहले से एनोटेट डेटा से deduced किया जा सकता है जहां स्क्रीनिंग के लिए जाना जाता bioactives की एक दवा पुस्तकालय का चयन करने के लिए है. साथ ही, chemoinformatic एल्गोरिदम, डिस्कवरी गेट की तरह, जिम्मेदार माना तंत्र के साथ 14 यौगिकों का एक डाटाबेस के खिलाफ एक यौगिक के संरचनात्मक समानता तुलना कर सकते हैं कि उपयोग के लिए उपलब्ध हैं. अभी तक एक यौगिक के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक और रास्ता एक माइकर उत्पन्न करने के लिए किया जाएगाoarray उपचार के बाद प्रोफ़ाइल और फिर एक समान प्रभाव 14 बटोर कि mechanistically परिभाषित यौगिकों के लिए खोज, ऐसी कनेक्टिविटी नक्शे के रूप में माइक्रोएरे दवा प्रोफाइल, का एक संकलन में इस प्रोफाइल क्वेरी. यह दृष्टिकोण भी ब्याज की यौगिक के रूप में एक समान प्रभाव है कि आनुवंशिक म्यूटेंट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक परिसर और एक उत्परिवर्ती के बीच एक कनेक्शन ढूँढना यौगिक molecularly नदी के ऊपर या यौगिक और morpholinos साथ म्यूटेंट के इलाज से चित्रित किया जा सकता है जो संबंधित जीन, के बहाव से काम करता है कि सुझाव दे सकता है. एक अन्य विकल्प zebrafish के लिए अधिक अनुकूलित बनने के लिए जारी है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री, होगा. इस विधि दवा उपचार के बाद विशेष प्रोटीन परिवर्तन या बाद translational संशोधनों को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, छोटे अणुओं या यहाँ तक कि पूरे पुस्तकालयों बंधन भागीदारों के पुल से नीचे के लिए चिह्नित किया जा रहा से कभी कभी सक्षम हैं. यह भी ध्यान देने योग्य है कि जबकि कैसे एक छोटा सा अणु कार्यों का तंत्र मैंमहत्वपूर्ण आयात की है, तंत्र अनजान रहते हैं, जिसके लिए एफडीए को मंजूरी दी दवाओं रहे हैं.
Zebrafish दोनों आनुवंशिक रूप से और physiologically स्तनधारियों के लिए कई समानताएं प्रदर्शन हालांकि, अभी भी दवा क्रॉसओवर 14 का एक मुद्दा है. एक अध्ययन में zebrafish भ्रूण 50 में सेल चक्र अवरोधकों के लिए एक स्क्रीन से हिट की विदेशी क्षमता की जांच की. स्क्रीन सेल चक्र गतिविधि के अधिकारी पहले से अनजान थे कि 14 हिट की पहचान में हुई. इन 14 यौगिकों में से 6 दोनों मानव और zebrafish सेल संस्कृति assays में सेल चक्र गतिविधि पाए गए, 3, 1 केवल zebrafish कोशिकाओं में सक्रिय था सेल संस्कृति assays में सीरम निष्क्रिय होना दिखाया गया है, और 4 में कोई गतिविधि नहीं था या तो zebrafish या मानव सेल संस्कृति assays के, लेकिन केवल Zebrafish पूरा जीव में. विशेष रूप से, केवल zebrafish में गतिविधि था कि 4 यौगिकों prohi सकता है कि zebrafish और स्तनधारियों के बीच मतभेद हैं कि प्रदर्शितकुछ यौगिकों के translational संभावित काटा. यह, हालांकि स्तनधारियों में गुर्दे की वसूली की दर में सुधार है कि मानव प्राप्तकर्ताओं और PTBA-डेरिवेटिव में टीका लगाना करने HSCs की क्षमता बढ़ाता है जो पीजीई 2, इस प्रकार के सबूत उपलब्ध कराने जैसे छोटे अणुओं के उदाहरण हैं, वहाँ के प्रति जागरूक होने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है सिद्धांत की कि विदेशी 23,31-33 संभव है.
भले ही इन कमियों, रासायनिक आनुवंशिकी और यह कम से कम-संसाधन दृष्टिकोण के अनुसंधान समुदाय की पेशकश ज्यादा है. रासायनिक आनुवंशिकी zebrafish में विशेष रूप से उपयोगी है और आणविक मार्ग पूछताछ और दवाओं की खोज में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहेगा. असतत आणविक लक्ष्यों पर आधारित रासायनिक स्क्रीन ऐतिहासिक कारण सोखना, वितरण, चयापचय, उत्सर्जन, और विषाक्तता (ADMET) गुण 51 के नक्षत्र के रूप में जाना जाता है के लिए एक उच्च विफलता दर के अधीन किया गया है. करने के लिए zebrafish उपयोग रासायनिक स्क्रीनबल्कि एक असतत लक्ष्य की तुलना में, कई ADMET समस्याओं को दरकिनार और पूरे जीव के संदर्भ में प्रभावी रहे हैं कि यौगिकों की पहचान कर सकते हैं, एक प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित. वर्तमान उत्परिवर्ती उपभेदों और लक्षित आनुवंशिक म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक्स बनाने के लिए जीनोम संपादन का उपयोग करने की क्षमता सहित zebrafish अनुसंधान, के लिए उपलब्ध संसाधनों की बढ़ती पूल के साथ, zebrafish का उपयोग संभावित रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के एक असीम संख्या लगभग वहाँ रहे हैं. कई रासायनिक पुस्तकालयों curated, और ज्ञात bioactives, संरचनात्मक रूप विविध और structurally इसी उपन्यास यौगिकों, साथ अवधि संग्रह किया गया है. ये अभिकर्मकों वर्तमान में उपलब्ध हैं और आगे आने वाले वर्षों में बढ़ने की संभावना है कि स्क्रीन संयोजन के लिए आकर्षक अवसरों का खजाना प्रदान करते हैं. हाथ में इन संभावनाओं के साथ, इस पुस्तिका और उच्च throughput प्रोटोकॉल zebrafish का उपयोग रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन शुरू करने के लिए अनुसंधान समूहों की क्षमता को बढ़ाने के लिए एक व्यावहारिक और उपयोगकर्ता के अनुकूल रास्ता प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के बाद से Wingert अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए धन के द्वारा समर्थित किया गया था: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237 अनुदान; ऑफ डाइम्स तुलसी ओ'कॉनर स्टार्टर विद्वान अनुदान पुरस्कार # 5 FY12-75 के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज विश्वविद्यालय से धन शुरू; और Gallagher परिवार की ओर से एलिजाबेथ और माइकल Gallagher से नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के एक उदार उपहार स्टेम सेल शोध को बढ़ावा. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम पांडुलिपि पर गंभीर प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए पॉल टी Kroeger, जूनियर धन्यवाद. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारियों को धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके बकाया समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. अंत में, हम अपने शोध के सदस्यों को धन्यवादइस काम के बारे में उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और अंतर्दृष्टि के लिए चर्चा प्रयोगशाला.
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |