Slice It Hot: Острая взрослом мозге нарезки в физиологической температуре
Summary
In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Abstract
Здесь мы приводим протокол для подготовки острых срезах мозга. Эта процедура является важным элементом для электрофизиологических экспериментов патч-зажим, который в значительной степени определяет качество результатов. Было показано, что опуская стадии охлаждения во время резки процедуру полезно в получении здоровых ломтики и клетки, особенно при работе с высокой миелиновых структур головного мозга из зрелых животных. Даже при том, что точный механизм которой повышенная температура поддерживает нервную здоровье можно только предполагать на, само собой разумеется, что, когда это возможно, температура в которой выполняется нарезка должна быть близка к физиологическим условиям по предотвращению температуры, связанные артефакты. Еще одним важным преимуществом этого метода является простота процедуры и поэтому некоторое время подготовка. В продемонстрированной методом взрослых мышей используются, но та же самая процедура может быть применена с молодых мышей, а также крыс. Также, следующий патч клЭксперимент усилитель выполнен на горизонтальных срезов мозжечка, но та же самая процедура также может быть использован и в других самолетов, а также другие задних областях мозга.
Introduction
Целью предложенного метода является получение высококачественных острых кусочков мозга для в пробирке электрофизиологических экспериментов, особенно при использовании взрослого или даже старые животные.
Острая метод мозг нарезка, как описано Skrede и Westgaard 1 в двух элегантных приговоров, стал одним из основ современных исследований в области нейронаук и используется в бесчисленных вариациях по всему миру. Качество ломтиками отражается в количестве живых нейронов за среза, период времени, в течение которых клетки держать их электрофизиологических и морфологических свойств, а также в целостности ткани. Кроме того, максимальная продолжительность записи для стабильных зависит от качества срезов. Таким образом, вдоль десятилетий, оригинальный метод нарезки получила дальнейшее развитие отдельных исследовательских групп по повышению нефтеотдачи ломтик после резки 2-10, часто сложных модификаций состава резки оРешения г восстановления (например, добавление аскорбат, тиомочевины или даже H 2 O 2), а также внутри-сердечной предварительной перфузии животного с охлаждаемых физиологических растворов.
Как было недавно показано 11, физиологическая температура во время нарезки, кажется, более выгодным, чем охлаждение до нейронов здоровья; улучшение самое поразительное при работе со взрослыми (2-8 месяц) грызунов. Как избежать резких изменений температуры предотвращает артефактов из-за процессов в зависимости от температуры клеток, таких как пластичность 13 и ион-каналы кинетики 13,14. Такие изменения могут повлиять на мембранным напряжением и внутриклеточной сигнализации кальция, порог шип, и шип форму.
"Горячая" острый срез способ приготовления, представленные здесь, общая процедура для получения высококачественных острых кусочков мозга из любого региона мозга, в том числе в мозжечок, кору и гиппокамп, ядрах ствола мозга 16 </ SUP>, а также в обонятельной луковице, как у крыс и мышей.
Следует отметить, что процедура физиологический температура нарезки требуется, чтобы режущий диск вибрирует почти совершенно горизонтально и без каких-либо дефектов структуры. Такая точность не может быть достижимо с более старыми моделями среза; в таких случаях, мы рекомендуем вам провести подготовку ломтик в морозильных холодной условиях, низкая температура, кажется, делает ткани более устойчивы к механическим повреждениям, даже если ценой метаболических отклонений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Показано, способ получения острых срезах мозга мышей в физиологическом вместо ледяной температуры.
Было показано 11, что качество срезов, полученных в теплых условиях превосходит по сравнению с теми, подготовлен с холодных условиях, при условии, что резки лезвие им…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. . The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
