Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica
Summary
In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Abstract
Aqui apresentamos um protocolo para a preparação de fatias cerebrais agudas. Este procedimento é um elemento crítico para experiências de patch-clamp electrofisiológicas que determina em grande parte a qualidade dos resultados. Demonstrou-se que omitindo o passo de arrefecimento durante o processo de corte é benéfico na obtenção de cortes e células saudáveis, especialmente quando se lida com as estruturas cerebrais altamente mielinizadas de animais maduros. Embora o mecanismo preciso pelo qual temperatura elevada apoia a saúde neural só se pode especular em cima, é lógico que, sempre que possível, a temperatura em que o corte é realizado deve ser perto de condições fisiológicas para evitar artefatos de temperatura relacionados. Outra vantagem importante deste método é a simplicidade do processo e, por conseguinte, o tempo de preparação curto. No método demonstrado ratinhos adultos são usadas, mas o mesmo procedimento pode ser aplicado com ratos mais jovens, bem como os ratos. Além disso, os seguintes cl remendoamp experiência é realizada em fatias horizontais do cerebelo, mas o mesmo procedimento pode também ser utilizado em outros planos, bem como outras áreas do cérebro posterior.
Introduction
O objectivo do método apresentado é obter de alta qualidade fatias cerebrais agudas para experiências in vitro electrofisiológicas, especialmente quando se utiliza adulto ou mesmo animais mais velhos.
O método de fatiamento cerebral aguda, como descrito por Skrede e Westgaard 1 em duas frases elegantes, tornou-se um dos fundamentos da pesquisa em neurociência moderna e é empregado em inúmeras variações em todo o mundo. A qualidade das fatias é reflectido no número de neurónios por fatia vivo, o período de tempo durante o qual as células de manter as suas propriedades electrofisiológicas e morfológicas, bem como na integridade do tecido. Além disso, a duração máxima para gravações estáveis depende da qualidade das fatias. Assim, ao longo das décadas, o método de corte original foi desenvolvido por grupos de pesquisa individuais para melhorar a recuperação após o corte fatia 2-10, muitas vezes por meio de modificações complexas de composição de cortar osoluções de recuperação r (como a adição de ácido ascórbico, tioureia ou mesmo de H 2 O 2), bem como intra-cardíaca de pré-perfusão do animal com soluções fisiológicas arrefecidos.
Tal como foi recentemente mostrado 11, temperatura fisiológica durante o corte parece ser mais benéfico do que o arrefecimento para a saúde neuronal; a melhora é mais marcante quando se trabalha com adultos (2-8 meses) roedores. Evitar mudanças dramáticas de temperatura impede artefatos devido a processos dependentes da temperatura nas células, como plasticidade e 13 canais iónicos cinética 13,14. Tais mudanças podem influenciar a tensão de membrana e sinalização intracelular de cálcio, limiar pico e pico de forma.
O método "quente" fatia aguda preparação aqui apresentado é um processo geral para a obtenção de alta qualidade fatias cerebrais agudas a partir de qualquer região do cérebro, incluindo no cerebelo, córtex e no hipocampo, núcleos do tronco cerebral 16 </ Sup>, bem como o bolbo olfactivo, tanto em ratos e ratinhos.
Notavelmente, o procedimento temperatura fatiamento fisiológico requer que a lâmina de corte vibra quase perfeitamente na horizontal e é, sem quaisquer defeitos estruturais. Tal precisão pode não ser possível com modelos de cortador de idosos; em tais casos, é recomendável a realização da preparação fatia em condições de frio como a temperatura baixa parece tornar o tecido mais resistente a danos mecânicos, mesmo que à custa de aberrações metabólicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos um método para a preparação de fatias cerebrais agudas a partir de ratos em vez de temperatura fisiológica gelada.
Demonstrou-se 11 que a qualidade das fatias obtidas em condições de calor é superior quando em comparação com as preparadas com condições de frio, desde que a lâmina tem fatiador de vibração vertical mínima. Cortando na temperatura fisiológica pode impedir artefatos fisiológicos causados pela baixa temperatura, como as relacion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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