Slice It Hot: Agudo cerebrales en adultos rebanar en la temperatura fisiológica
Summary
In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Abstract
Aquí se presenta un protocolo para la preparación de cortes de cerebro agudas. Este procedimiento es un elemento crítico para los experimentos de patch-clamp electrofisiológicos que determina en gran medida la calidad de los resultados. Se ha demostrado que la omisión de la etapa de enfriamiento durante el procedimiento de corte es beneficioso en la obtención de rebanadas y las células sanas, especialmente cuando se trata de estructuras cerebrales altamente mielinizadas de animales maduros. Aunque el mecanismo exacto por el que la temperatura elevada favorece la salud de los nervios sólo puede especular sobre, es lógico pensar que, siempre que sea posible, la temperatura en la que se realiza el corte debe estar cerca de las condiciones fisiológicas para evitar los artefactos relacionados con la temperatura. Otra ventaja importante de este método es la simplicidad del procedimiento y por lo tanto el tiempo de preparación corto. En el método demostrado se utilizan ratones adultos pero el mismo procedimiento se puede aplicar con ratones más jóvenes, así como las ratas. También, las siguientes cl parcheamp experimento se realiza en rebanadas horizontales cerebelosos, pero el mismo procedimiento se puede utilizar también en otros planos, así como otras áreas posteriores del cerebro.
Introduction
El objetivo del método presentado es conseguir cortes de cerebro agudos de alta calidad para experimentos electrofisiológicos in vitro, especialmente cuando se utiliza adulto o incluso los animales de edad.
El método de corte cerebral agudo, tal como se describe por Skrede y Westgaard 1 en dos frases elegantes, se ha convertido en uno de los fundamentos de la investigación de la neurociencia moderna y está empleado en innumerables variaciones en todo el mundo. La calidad de las rodajas se refleja en el número de neuronas por rebanada viviente, el período de tiempo durante el cual las células mantienen sus propiedades electrofisiológicas y morfológicas, así como en la integridad del tejido. Además, la duración máxima para las grabaciones estables depende de la calidad de las rodajas. Por lo tanto, a lo largo de las décadas, el método de la división original ha sido desarrollado por los grupos individuales de investigación para mejorar la recuperación después de cortar la rebanada 2-10, a menudo por modificaciones complejas de la composición de corte osoluciones de recuperación r (tales como la adición de ascorbato, tiourea o incluso H 2 O 2), así como pre-perfusión intra-cardiaca del animal con soluciones fisiológicas enfriado.
Como se ha demostrado recientemente 11, temperatura fisiológica durante el corte parece ser más beneficiosa que la refrigeración para la salud neuronal; la mejora es más notable cuando se trabaja con adultos (2-8 meses) los roedores. Evitar cambios drásticos de temperatura evita artefactos debido a los procesos dependientes de la temperatura en las células, tales como la plasticidad y 13 canales de iones cinética de 13,14. Tales cambios podrían influir en la tensión de la membrana y la señalización del calcio intracelular, el umbral de pico y pico de forma.
El método "caliente" rebanada aguda preparación que aquí se presenta es un procedimiento general para la obtención de cortes de cerebro agudos de alta calidad desde cualquier región del cerebro, incluyendo el cerebelo, la corteza y el hipocampo, núcleos de helio tronco cerebral 16 </ Sup> así como el bulbo olfatorio, tanto en ratas y ratones.
En particular, el procedimiento de corte en lonchas temperatura fisiológica requiere que la cuchilla de corte vibra casi perfectamente horizontal y es sin defectos estructurales. Tal precisión podría no ser alcanzable con los modelos de máquina de cortar de edad avanzada; en tales casos, se recomienda la realización de la preparación rebanada en condiciones de congelación frío como la temperatura baja parece tener el tejido más resistente a los daños mecánicos, aunque a costa de las aberraciones metabólicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se demuestra un método para la preparación de cortes de cerebro de ratones agudas en lugar de la temperatura fisiológica enfriada con hielo.
Se ha demostrado 11 que la calidad de las rebanadas obtenidas en condiciones de calor es superior en comparación con los preparados con condiciones de frío, a condición de que la cuchilla rebanadora tiene vibración vertical mínima. El rebanar de la temperatura fisiológica puede evitar artefactos fisiológicos causados por la ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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