Slice It Hot: aiguë cerveau adulte trancher dans physiologique Température
Summary
In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Abstract
Nous présentons ici un protocole de préparation des tranches de cerveau de courte durée. Cette procédure est un élément essentiel pour électrophysiologiques expériences de patch-clamp qui détermine en grande partie la qualité des résultats. Il a été démontré que l'omission de l'étape de refroidissement durant la procédure de coupe est bénéfique pour obtenir des tranches et des cellules saines, en particulier lorsque des structures cérébrales fortement myélinisées provenant d'animaux adultes. Même si le mécanisme précis par lequel la température élevée favorise la santé de neurones ne peut être spéculé sur, il va de soi que, chaque fois que possible, la température à laquelle le découpage est effectué devrait être proche des conditions physiologiques pour éviter les artefacts liés à la température. Un autre avantage important de cette méthode est la simplicité de la procédure et donc le temps de préparation court. Dans la méthode illustrée souris adultes sont utilisés mais la même procédure peut être appliquée à des souris jeunes, ainsi que les rats. En outre, les cl de patch suivantsexpérience ampères est effectuée sur des tranches horizontales du cervelet, mais la même procédure peut également être utilisée dans d'autres plans, ainsi que d'autres zones postérieures du cerveau.
Introduction
Le but de la méthode présentée est d'obtenir des tranches de cerveau aigus de haute qualité pour des expériences électrophysiologiques in vitro, en particulier lors de l'utilisation adulte ou même des animaux anciens.
La méthode de découpage cerveau aiguë, comme décrit par Skrede et Westgaard 1 en deux phrases élégantes, est devenu l'un des fondements de la recherche en neurosciences modernes et est utilisé dans d'innombrables variations dans le monde entier. La qualité des tranches est reflété dans le nombre de neurones par tranche de vie, la période de temps pendant laquelle les cellules gardent leurs propriétés électrophysiologiques et morphologiques ainsi que l'intégrité du tissu. De plus, la durée maximale des enregistrements stables dépend de la qualité des tranches. Ainsi, le long des décennies, la méthode de découpage original a été développé par des groupes de recherche individuels pour améliorer la récupération de la tranche après la coupe 2-10, souvent par des modifications complexes de la composition de la coupe osolutions de récupération de r (telles que l'ajout d'ascorbate, de la thiourée ou même H 2 O 2) et de pré-perfusion intra-cardiaque de l'animal avec des solutions physiologiques refroidi.
Comme il a été récemment montré 11, température physiologique pendant le découpage semble être plus bénéfique que le refroidissement de la santé neuronale; l'amélioration est la plus frappante lorsque l'on travaille avec des adultes (2-8 mois) les rongeurs. Eviter les variations de température considérables empêche artefacts dus à des processus dépendant de la température dans les cellules, telles que la plasticité 13 et la cinétique des canaux ioniques 13,14. De tels changements pourraient influencer la tension de la membrane et de la signalisation intracellulaire de calcium, le seuil de pic, pic et forme.
La méthode "chaude" de la tranche aiguë de préparation présenté ici est une procédure générale pour obtenir des tranches de cerveau aigus de haute qualité à partir de toutes les régions du cerveau, y compris le cervelet, le cortex et l'hippocampe, le tronc cérébral noyaux 16 </ Sup>, ainsi que le bulbe olfactif, à la fois chez les rats et les souris.
En particulier, la procédure de découpe de la température physiologique nécessite que la lame de coupe vibre à peu près à l'horizontale, et est sans défaut de structure. Cette précision pourrait ne pas être réalisable avec des modèles de trancheuses âgées; dans de tels cas, nous vous recommandons d'effectuer la préparation de tranches dans des conditions de gel-froid comme la basse température semble rendre le tissu plus résistant aux dommages mécaniques, même si au prix d'aberrations métaboliques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous démontrons un procédé de préparation de coupes de cerveau de souris en aigus physiologique au lieu de la température de la glace.
Il a été démontré 11 que la qualité des tranches obtenues dans des conditions de chaleur est supérieure par rapport à ceux qui sont préparés avec des conditions de froid, à condition que la lame à trancher a un minimum de vibrations verticales. Tranchage de la température physiologique peut éviter des artefacts physiologiques caus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. . The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
