La ligature très efficace de petites molécules d'ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Les miARN clonage et le séquençage à haut débit, appelés miR-Seq, représente à elle seule une approche transcriptome à l'échelle de quantifier miARN avec une résolution d'un seul nucléotide. Cette technique de fixation par capture miARN adaptateurs 3 'et 5' des molécules oligonucléotidiques miARN et permet la découverte de novo miARN. Couplage avec puissantes plates-formes de séquençage de nouvelle génération, miR-Seq a joué un rôle dans l'étude de la biologie des miARN. Cependant, des biais importants introduits par oligonucléotides étapes de ligature ont empêché miR-Seq d'être utilisé comme un outil de quantification précise. Des études antérieures montrent que les biais dans les méthodes miR-Seq actuelles conduisent souvent à inexacts quantification miRNA avec des erreurs jusqu'à 1000 fois pour certains miARN 1,2. Pour résoudre ces biais conférées par la ligature de l'ARN, nous avons mis au point une méthode de ligature petit ARN qui conduit à l'efficacité de ligature de plus de 95% pour les 3 'et 5' des étapes de ligature. Analyse comparative de cette improuvé méthode de construction de bibliothèques utilisant miARN synthétiques équimolaires ou différentielle mixtes, donne constamment lit numéros avec un écart de moins de deux fois de la valeur attendue. En outre, cette haute efficacité méthode miR-Seq permet précise l'échelle du génome miRNA profilage à partir d'échantillons d'ARN totaux in vivo 2.
Introduction
Méthodologies basées séquençage haut-débit ont été largement appliquées à de nombreux échantillons biologiques au cours des dernières années d'expansion grandement notre compréhension de la complexité moléculaire des systèmes biologiques 3,4. Cependant, la préparation des échantillons d'ARN pour le séquençage à haut débit donne souvent des biais spécifiques inhérentes à la méthodologie employée, ce qui limite l'utilité potentielle de ces techniques puissantes. Ces méthodes spécifiques biais ont été bien documentés pour les préparations à base de bibliothèque ligature, petit-ARN 1,2,5,6. Ces préjugés se traduisent par 1000 fois la variation de lit nombre de miARN synthétiques équimolaires, ce qui rend l'inférence de miARN abondance de données de séquençage sauvagement variable et sujette à l'erreur.
Les études portant sur les propriétés de la T4 ligase d'ARN de phages dérivés ont démontré que les enzymes présentent préférences fondées nucléotides 7, qui se manifestent bibliothèques comme biaisés dans des expériences de séquençage à haut débit <sjusqu'à> 1,2,8. Afin de minimiser les distorsions conférées par des ligases d'ARN, plusieurs stratégies ont été employées; macromoléculaire encombrement 9, randomiser la séquence nucléotidique de l'adaptateur qui est à proximité du site de ligature 6, et en utilisant des concentrations élevées de ligature adaptateur 2. Grâce à une combinaison de ces trois approches, nous avons développé un flux de travail pour la préparation impartiale de petites bibliothèques d'ARN compatibles pour le séquençage à haut débit (Figure 1). Pour les comparaisons directes entre les protocoles actuels et notre méthode optimisée, se il vous plaît vous référer à notre récent rapport 2. Cette méthode donne des efficacités optimisé de ligature de plus de 95% à la fois en 3 'et 5' et des mesures permettant la ligature sans biais de petites molécules d'ARN à partir d'échantillons biologiques et de synthèse 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthodologie décrite ici fait usage de plusieurs variables clés pour maximiser l'efficacité de la ligature, à savoir de fortes concentrations de PEG, l'utilisation de linkers randomisés, et une forte concentration de linkers 2,6,9. Cette approche permet aux bibliothèques de séquençage fiable quantitatives à partir d'échantillons d'ARN total 2. Nous avons effectué plusieurs titrages d'ARN d'entrée et avons conclu que la méthode précédente est le mieux adapt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
References
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