Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
MiRNA klonlama ve yüksek verim sıralama, miR-Dizi, tek nükleotid çözünürlükte miRNA'lar ölçmek için bir transcriptome geniş bir yaklaşım olarak tek başına duruyor adlandırılır. Bu teknik MiRNA moleküllere 3 've 5' oligonükleotid adaptörler takılarak miRNA'lar yakalar de novo miRNA keşif sağlar. Güçlü yeni nesil dizileme platformları ile birleştirilmesi sonucu, miR-Seq miRNA biyoloji çalışmaya vesile olmuştur. Ancak, oligonükleotid ligasyon adımlarla tarafından tanıtıldı önemli önyargılar doğru bir kantitasyon aracı olarak istihdam edilmesini miR-seg engellemiştir. Önceki çalışmalar, mevcut miR-Dizi yöntemleri önyargıları genellikle bazı miRNA'ların 1,2 1.000 kata kadar hataları ile yanlış miRNA miktar yol açtığını göstermektedir. RNA ligasyonu ile kazandırılan bu önyargıları gidermek için, biz de 3 've 5' ligasyon adımlar için% 95'in üzerinde ligasyonu verimliliği ile sonuçlanan bir küçük RNA ligasyonu yöntemi geliştirdik. Bu im Kıyaslamasürekli beklenen değerden az iki kat sapmayla numaraları okur verir, eşit molar veya farklı olarak karışık sentetik miRNA'lar kullanarak kitaplık inşaat yöntemi olduğunu kanıtladı. Ayrıca, bu yüksek verimli miR-Dizi yöntem in vivo toplam RNA örneklerinde 2 doğru genom miRNA profilleme izin verir.
Introduction
Yüksek verim sıralama tabanlı metodolojileri yaygın ölçüde biyolojik sistemlerin 3,4 moleküler karmaşıklığı anlayışımızı genişleyen son yıllarda birçok biyolojik numunelere uygulanmıştır. Ancak, yüksek sekanslama için RNA örneklerinin hazırlanması çoğu zaman, bu güçlü teknikleri potansiyel kullanımını sınırlayan çalışan yönteme özgü belirli bir yanlılığı kazandırır. Bu yöntem, belirli önyargıları iyi ligasyon-temelli, küçük RNA kütüphane hazırlıkları 1,2,5,6 için belgelenmiştir. Bu önyargıları 1,000 kat varyasyon çılgınca değişken ve hata eğilimli sıralama verilerinden miRNA bereket çıkarsama yapma, eşit molar sentetik miRNA'ların için sayıları okur sonuçlanabilir.
Faj türevli, T4 RNA ligazların özelliklerine odaklanarak çalışmalar enzimler yüksek verimli sekanslama deneylerde belirlendiği gibi yanlı kitaplıkları ortaya nükleotid bazlı tercihleri 7, olduğu belgelenmiştir adres <s1,2,8> kadar. RNA, ligazlar tarafından kazandırılan hatalarını en aza indirmek için, birden fazla stratejiler kullanılmıştır; makromoleküler, 9 boğmakta ligasyon siteye 6 proksimalinde adaptör üzerinde nükleotid dizisi randomizing ve ligasyon adaptörü 2 yüksek konsantrasyonlarda istihdam. Bu üç yaklaşımların bir kombinasyonu sayesinde yüksek verimlilik sıralaması (Şekil 1) uyumlu küçük RNA kütüphanelerin tarafsız hazırlanması için bir iş akışı geliştirdik. Mevcut protokoller ve optimize edilmiş bir yöntemle arasında doğrudan karşılaştırmalar için, bizim son raporunda 2 başvurun. Bu optimize edilmiş yöntem her iki 3 've 5' aşamalarında% 95'ten ligasyonu verim alınmasını sağlamaktadır, sentetik ve biyolojik örnekler 2 küçük RNA moleküllerinin tarafsız bağlanmasını izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tarifnamede anlatılan yöntemler, bağlama verimliliği, yani PEG, randomize bağlayıcıların kullanımı yüksek konsantrasyonlarda ve bağlayıcıların 2,6,9 yüksek konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için birkaç anahtar değişkenlerden kullanır. Bu yaklaşım, total RNA örnekleri 2 güvenilir kantitatif sıralama kütüphaneleri izin verir. Biz giriş RNA'nın çoklu titrasyonlarını yaptık ve önceki metodoloji (veriler gösterilmemiştir) 1-8 mikrogram aralığında to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
