Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna clonagem e sequenciamento de alto rendimento, denominada miR-Seq, assume-se como uma abordagem ampla transcriptoma quantificar miRNAs com resolução de nucleotídeo único. Esta técnica de captura miARNs, anexando os adaptadores 3 'e 5' de oligonucleótidos para moléculas de miARN e permite a descoberta de novo miARN. Acoplamento com plataformas de sequenciamento de próxima geração poderosos, miR-Seq tem sido fundamental para o estudo da biologia miRNA. Contudo, desvios significativos introduzidas por passos de ligação de oligonucleótidos têm impedido o miR-SEQ de ser empregado como uma ferramenta de quantificação precisa. Os estudos anteriores demonstram que polarizações em métodos de miR-Seq actuais conduzem frequentemente a quantificação imprecisa miARN com erros de até 1.000 vezes superior para algumas miARNs 1,2. Para resolver estes preconceitos, transmitidas por meio de ligação de ARN, temos desenvolvido um método de ligação de ARN pequenas que resulta em eficiências de ligação de mais de 95% tanto para 3 'e 5' etapas de ligação. O benchmarking este improvou método de construção da biblioteca utilizando miARNs equimolares sintéticos ou mistos diferencialmente, produz consistentemente lê números com desvio inferior a duas vezes a partir do valor esperado. Além disso, essa alta eficiência método miR-Seq permite preciso de todo o genoma miRNA perfil de in vivo total de amostras de RNA 2.
Introduction
Metodologias baseadas em alta capacidade de sequenciamento têm sido amplamente aplicada em muitas amostras biológicas nos últimos anos em expandir muito a nossa compreensão da complexidade molecular de sistemas biológicos 3,4. No entanto, a preparação de amostras de RNA de high-throughput seqüenciamento muitas vezes transmite preconceitos específicos inerentes à metodologia empregada, o que limita a utilidade potencial destas técnicas poderosas. Estes método específico polarizações ter sido bem documentado para preparações de biblioteca, de pequena ligadura de ARN baseado em 1,2,5,6. Estes preconceitos resultar em variação mil vezes na lê números de miRNAs sintéticos equimolares, fazendo inferência de abundância miRNA a partir de dados de sequenciamento descontroladamente variável e sujeito a erros.
Os estudos focam as propriedades de ligases T4 RNA derivadas de fagos têm documentado que as enzimas exibem preferências à base de nucleótidos 7, que se manifestam como bibliotecas enviesados em experiências de sequenciação de alto rendimento <saté> 1,2,8. A fim de minimizar os preconceitos transmitidos por ligases RNA, várias estratégias têm sido empregadas; macromolecular aglomerando 9, randomizando a sequência de nucleótidos do adaptador que é proximal em relação ao local de ligação 6, e empregando concentrações elevadas de adaptador de ligação 2. Através de uma combinação destes três abordagens temos desenvolvido um fluxo de trabalho para a preparação isenta de bibliotecas de ARN pequenas compatíveis para a sequenciação de alto rendimento (Figura 1). Para comparações diretas entre os protocolos atuais e nosso método otimizado, por favor consulte o nosso recente relatório 2. Este método produz optimizado eficiências de ligação de mais de 95% em ambas as 3 'e 5' etapas e permite a ligação isenta de moléculas de ARN a partir de pequenas amostras biológicas sintéticas e 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
A metodologia aqui descrita faz uso de diversas variáveis-chave para maximizar a eficiência de ligação, ou seja, altas concentrações de PEG, o uso de ligantes randomizados, e alta concentração de ligantes 2,6,9. Esta abordagem permite que bibliotecas de sequenciamento de forma confiável quantitativos a partir de amostras de RNA total de 2. Nós conduzimos várias titulações de ARN de entrada e concluíram que a metodologia anterior é o mais adequado para quantidades de ARN total na gama…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
