उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा MicroRNA quantitation के लिए छोटे आरएनए अणुओं की अत्यधिक कुशल Ligation
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna क्लोनिंग और उच्च throughput अनुक्रमण, मीर Seq, एकल nucleotide संकल्प के साथ miRNAs यों एक transcriptome चौड़ा दृष्टिकोण के रूप में अकेला खड़ा करार दिया. इस तकनीक miRNA के अणुओं को 3 'और 5' oligonucleotide एडाप्टर संलग्न द्वारा miRNAs कब्जा है और नए सिरे से miRNA खोज की अनुमति देता है. शक्तिशाली अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्म के साथ युग्मन, मीर Seq miRNA के जीव विज्ञान के अध्ययन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. हालांकि, oligonucleotide बंधाव कदम द्वारा शुरू की महत्वपूर्ण पूर्वाग्रहों एक सटीक quantitation के उपकरण के रूप में नियोजित किया जा रहा से मीर Seq रोका. पिछले अध्ययनों वर्तमान मीर Seq तरीकों में पूर्वाग्रहों अक्सर कुछ miRNAs 1,2 के लिए 1,000 गुना तक का त्रुटियों के साथ गलत miRNA मात्रा का ठहराव के लिए नेतृत्व कि प्रदर्शित करता है. शाही सेना बंधाव द्वारा दिया इन पूर्वाग्रहों को हल करने के लिए, हम दोनों '3 और 5' बंधाव कदम के लिए 95% से अधिक की बंधाव क्षमता में यह परिणाम है कि एक छोटे आरएनए बंधाव तरीका विकसित किया है. इस आईएम बेंचमार्किंगलगातार उम्मीद मूल्य से कम से कम दो गुना विचलन के साथ नंबर पढ़ता पैदावार, equimolar या विभिन्न मिश्रित सिंथेटिक miRNAs का उपयोग पुस्तकालय निर्माण विधि साबित कर दिया. इसके अलावा, यह उच्च दक्षता मीर Seq विधि में विवो कुल शाही सेना के नमूने 2 से सटीक जीनोम चौड़ा miRNA रूपरेखा देता है.
Introduction
उच्च throughput अनुक्रमण आधारित तरीके में व्यापक रूप से काफी जैविक प्रणालियों 3,4 की आणविक जटिलता के बारे में हमारी समझ को विस्तार हाल के वर्षों में कई जैविक नमूने के लिए लागू किया गया है. हालांकि, उच्च throughput अनुक्रमण के लिए शाही सेना के नमूने की तैयारी अक्सर इन शक्तिशाली तकनीक के संभावित उपयोगिता सीमित नियोजित कार्यप्रणाली के लिए निहित विशिष्ट पूर्वाग्रहों, प्रदान करता है. ये विधि विशिष्ट पूर्वाग्रहों अच्छी तरह बंधाव आधारित, छोटे-शाही सेना पुस्तकालय तैयारी 1,2,5,6 के लिए प्रलेखित किया गया है. इन पूर्वाग्रहों 1,000 गुना विभिन्नता में बेतहाशा चर और त्रुटि प्रवण अनुक्रमण डेटा से miRNA बहुतायत का अनुमान है, जिससे equimolar सिंथेटिक miRNAs के लिए संख्या पढ़ता परिणाम.
फेज-व्युत्पन्न टी -4 आरएनए ligases के गुणों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन एंजाइमों उच्च throughput अनुक्रमण प्रयोगों में के रूप में पक्षपाती पुस्तकालयों प्रकट जो न्यूक्लियोटाइड आधारित वरीयताओं 7, प्रदर्शन है कि दस्तावेज है <s1,2,8> ऊपर. शाही सेना ligases द्वारा दिया पूर्वाग्रहों को कम करने के लिए, कई रणनीतियों नियोजित किया गया है; macromolecular, 9 भीड़ बंधाव साइट से 6 समीपस्थ है जो एडाप्टर पर न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम randomizing, और बंधाव एडाप्टर 2 की उच्च सांद्रता को रोजगार. इन तीन तरीकों में से एक संयोजन के माध्यम से हम उच्च throughput अनुक्रमण (चित्रा 1) के लिए संगत छोटे आरएनए पुस्तकालयों की निष्पक्ष तैयार करने के लिए एक कार्य-प्रवाह का विकास किया है. मौजूदा प्रोटोकॉल और हमारे अनुकूलित विधि के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए, हमारे ताजा रिपोर्ट 2 देखें. यह अनुकूलित विधि दोनों 3 'और' 5 चरणों में 95% से अधिक की बंधाव क्षमता पैदावार और सिंथेटिक और जैविक नमूने 2 से छोटे आरएनए अणुओं की निष्पक्ष बंधाव देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ वर्णित पद्धति बंधाव क्षमता, अर्थात् खूंटी, बेतरतीब Linkers के उपयोग की उच्च सांद्रता, और Linkers 2,6,9 के उच्च एकाग्रता को अधिकतम करने के लिए कई महत्वपूर्ण चर का उपयोग करता है. यह दृष्टिकोण कुल शाही…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
References
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