פרוטוקול עבור לימוד ההכחדה של פחד אוויר באופן טבעי רכיבה על אופני חולדות נקבות
Summary
Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.
Abstract
הכחדה של פחד מותנה נחקרה בהרחבה במכרסמים זכר. לאחרונה, היה מספר גדל והולך של מחקרים המראים כי מנגנונים עצביים למשימות התנהגותיות מסוימות והתנהגויות תגובה שונים אצל נשים וגברים. שימוש בנשים במחקרים יכול לייצג אתגר בגלל הווריאציה של הורמוני אשכים במהלך מחזור הייחום שלהם. פרוטוקול זה מתאר נהלים מבוססים היטב כי הם שימושיים בחקירת תפקידו של אסטרוגן בגיבוש זיכרון הכחדת פחד בחולדות נקבות. שלב של מחזור הייחום וממשל אסטרוגן אקסוגני לפני אימון הכחדה יכול להשפיע על זיכרון הכחדה 24 שעות מאוחר יותר. טכניקת שטיפת הנרתיק לזיהוי שלב ייחום המתואר כאן מסייעת בחינה ומניפולציה של מטבע רכיבה על אופניים הורמוני אשכים. השימוש במודל מכרסם בסיסי זה עשוי להתוות עוד יותר את המנגנונים שבאמצעותם אסטרוגן יכול לווסת את זיכרון הכחדת פחד בנקבות.
Introduction
הבדלים בין מינים הטמונים הם נצפו על פני התנהגויות קוגניטיביות שונות ופרדיגמות למידה בשני בני אדם ומכרסמים. לדוגמא, זה כבר דווח כי, בדרך כלל, לנשים יש יכולות מילוליות ואורינטצית פירוט חזקות, בעוד שגברים יש יכולות מרחבית טובות יותר 1-3. הבדלים בין מינים אלה עשויים להיות בין שאר כתוצאה מההשפעה של הורמוני אשכים. רמות אסטרדיול גבוהות לשפר את הביצועים במשימות שבו נשים הן יותר טובים, אבל להחמיר את הביצועים במשימות שגברים בדרך כלל עושים טובים 4-6. למרות עדות זו היא משכנעת, היכולת המוגבלת לשלוט לחלוטין סביבות ניסוי במחקרים בבני אדם עושה את זה קשה לקבוע אם ניתן לייחס את ההשפעות הללו על התנהגות ספציפית להורמונים. מחקרים בבעלי חיים, לעומת זאת, מאפשרים לנסיבות בשליטה מלאה.
למרות המנגנונים העצביים הבסיסיים של הכחדת פחד זוהו ונלמדים גם בגברים, לא ברור אםמערכות אלה הן אותם בנקבות או איך הם משתנים לאורך מחזור הייחום. אוויר פחד והכחדה נמצאים בשימוש נרחב פרדיגמות התנהגות במכרסמים ובני אדם לבצע מחקרים הקשורים להפרעות חרדה. בהתחשב בכך שיש לי נשים בסיכון גבוה יותר להפרעות חרדה, כמו גם משך סימפטום גבוה יותר ובחומרה 7-13, זה קריטי לכולל נקבות במחקרים אלה. תת-הייצוג של נשים במחקר זה ניתן לייחס לאתגרים של ניטור ייחום שלב וחשבונאיים להשפעות ההתנהגותיות של הורמוני מין. מעבדות שעושות לבחון נקבות בסוגיות מפגש הקשר זה, כי לעתים קרובות אינו מדווח או אינם מתואר בשיטות ללימודיהם.
מתעורר ראיות במכרסמים מצביע על כך שהבדלים בין מינים בהכחדת פחד הם מווסתים על ידי הורמוני אשכים 14-18. בפחד אוויר, הם מאומנים לפחד גירוי מסוים. לאחר מספר מצגות unreinforced שלהגירוי, בעלי החיים ללמוד לא לפחד קיו, תהליך הנקרא הכחדה. כמה טוב בעלי החיים לומדים ומאחדים את הזיכרון של למידת משימה זו ניתן לצפות במהלך בדיקת זיכרון הכחדה נתנה כמה זמן אחרי אימון ההכחדה. ביטוי פחד פחות בזכרון הכחדה מדגים גיבוש זיכרון הכחדה טוב. ממצאים אחרונים מהמעבדה שלנו מציעים כי אסטרוגן יכול לווסת את האיחוד של זיכרון הכחדת פחד ולשפר את זיכרון הכחדה. באופן ספציפי, חולדות נקבות שכובו בproestrus, השלב של מחזור הייחום שבמהלכו במחזור שיא רמות האסטרוגן, שימור משופר תערוכת זיכרון הכחדה. בניגוד לכך, נשים שכבו בתצוגת שלב metestrus אסטרוגן הנמוך זוכרת הכחדה עניה יחסית, שניתן לשפר עם ממשל אסטרדיול אקסוגניים לפני או מייד לאחר אימון הכחדת 15,16. המנגנונים העצביים של גיבוש זיכרון הכחדה (כולל מע"מuding את התפקיד של הורמוני אשכים) בנקבות אינם ברורים.
בחיות מעבדה, התפקיד של הורמונים יכול להיחקר באמצעות נהלי הסרה כירורגית פולשנית כגון סירוס וovariectomy. לאחר התאוששות מניתוח, הורמוני אשכים לעתים קרובות מניפולציות אקסוגני בזמן ההופעה של משימה התנהגותית 19. גישה זו סיפקה מידע קריטי על הורמוני מין ושימושי משום שהיא מאפשרת למניפולציות מבוקרות היטב של הורמוני אשכים (במונחים של תזמון ומינון) 20-23. גישה זו, עם זאת, לא להעריך את ההשפעה של התנודות טבעיות המתרחשות על פני מחזור הייחום וגם אינו מייצגים בעלי חיים "נורמלים", וכך להגביל את פוטנציאל translational למחקרים בבני אדם. זה תועד היטב כי שיא רמות הורמון מין נשי וירידה בשלבים מסוימים של מחזור הייחום, וביטוי קולטן אסטרוגן שינויים במחזור,ואחרי ovariectomy 24. לפיכך, יש צורך לערוך מחקרים על נשים עם בלוטות מין שלמים ולשפר את העיצוב ניסיוני ללמוד באופן מהימן את ההשפעות שמדינות אסטרוגן גבוהות ונמוכות עשויות להיות בנקבות בכל תוחלת החיים שלהם.
פרוטוקול זה מתמקד בהשפעה של אסטרוגן על מערכות נוירו-הביולוגיות מעורבות בהכחדת פחד. הוא מתאר כיצד: 1) לפקח בזהירות את מחזור הייחום, 2) להכין מינונים אפקטיביים של אסטרדיול לממשל מערכתי, ו- 3) לעקוב אחר פרדיגמה התנהגות הכוללת אוויר פחד, הכחדה, ולהיזכר בחולדות נקבות באופן טבעי רכיבה על אופניים. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עם מניפולציות תרופתיות אחרות וכלים תאיים ומולקולריים כדי לסייע מחקרים כדי להבין טוב יותר הבדלים בין מינים שנצפו במותנה פחד הכחדת התנהגות. שים לב כי הנהלים המפורטים להלן הם אלה המשמשים במעבדה שלנו, וקיים מספר הווריאציות של נהלים אלה in הספרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכחדת פחד, נחקרה בהרחבה בחולדות זכרים עם המנגנונים העצביים תיווך הכחדת פחד מותנה לזהות ולהעריך תחת מניפולציות שונות. מעטים יחסית מחקרים בחנו חולדות נקבות או את התפקיד של הורמוני אשכים בהכחדת פחד. ללמוד באופן ספציפי את ההשפעה של אסטרוגן על הכחדת פחד, חולדות נקבות באו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
